Electroforesis

Mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas (cidos nucleicos, protenas) segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa.

Tcnicas

Northern blot: separacin de molculas de ARN transferencia a una matriz se fija Southern blot: separacin de molculas de ADN transferencia a una matriz se fija Western blot: separacin de protenas transferencia a una matriz se adhiere anticuerpo especfico se fija

Procedimiento General

A) Cultivo tisular B) Lisado celular y obtencin de protenas. C) Electroforesis en gel de poliacrilamida . D) Transferencia de las protenas a un papel de nitrocelulosa. E) Incubacin del papel con suero del paciente. F) Si existen anticuerpos para el Antgeno en el suero, stos se unirn fuertemente a las protenas transferidas al papel y se detectarn como bandas oscuras (f).

Procedimiento General

Los anticuerpos primarios pueden detectarse a travs de dos mtodos: 1) Usando protena A o protena G 2) Con la participacin de un segundo anticuerpo

Tanto la protena A como la protena G son protenas que se aislan de la pared celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la regin Fc de los anticuerpos. Ambas pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros marcadores. La protena G tiene una capacidad de reconocimiento ms amplia que la protena A.

Anticuerpos secundarios:
-Anticuerpos anti-anticuerpos -Anticuerpos monoclonales

-Fragmentos Fab2, producidos mediante digestin con pepsina de los anticuerpos puros

Ensayo de transferencia Western para VIH

Es un enzimoinmunoensayo cualitativo para la deteccin in vitro de anticuerpos frente a los virus de VIH-1 y VIH-2, en suero o plasma humanos. Es ms especifico para la deteccin de VIH en plasma o suero.

Se utiliza electroforesis y electrotransferencia para la adhesin de antgeno vrico del VIH-1.

Pptido sinttico especfico contra VIH-2. Control interno para reducir el riesgo de falsos negativos.

Principios quimicos y biologicos

Lavado

Tiras de nitrocelulosa +VIH1+VIH2

Se observa la union de estos a los antigenos y proteinas

Reacciones con anticuerpos de cabra anti IgG humana

Incubacin en control y diluidos

Si presentan anticuerpos frente VIH1 y VIH2

Deteccion de cantidades nfimas de anticuerpos.

Componentes del kit

Tiras de nitrocelulosa Control no reactivo Control reactivo fuerte Control reactivo debil Tampn de blotting concentrado (10x) Tampon de lavado concentrado (20X) Conjugado Sustrato Polvo de blotting

Control de Calidad

Debe cumplir con las siguientes condiciones:

Control no reactivo: no bandas especficas

de VIH1 u VIH2. la banda control debe ser visible. Control reactivo fuerte: todas las bandas de peso molecular que corresponda deben ser visibles. Control reactivo dbil: medida de sensibilidad del kit. Las bandas del control de suero deben ser visibles.

Interpretacin de los resultados

Tiras deben estar completamente secas.

Se determina comparando cada tira de nitrocelulosa con las tira de control de ensayo con los controles No reactivo, Reactivo Fuerte y Reactivo Dbil. Algunos antgenos derivan de las mismas protenas precursoras y pueden tener epitopos superpuestos.

Verificar que la banda de control del suero sea visible Identificacion del peso molecular de cada banda de la tira de analisis utilizando como guia las tiras de control reactivo Fuerte, Debil o ambos. Interpretacion de las tiras de analisis segn las autoridades pertinentes.

PMENV
Gp 160

GEN
ENV

Antgeno
Forma polimerica de la gp41

Descripcin
Ancha y difusa de glucoproteina

Gp 120
p66 p55 p51

ENV
POL GAG POL

Membrana externa
Transcriptasa inversa Proteina precursora Transcriptasa inversa

Difusa de glucoproteina
Banda discreta Banda discreta Banda discreta justo por debajo de p55

p39
gp41

GAG
ENV

Fragmento de p55 Banda discreta

Transmembrana Difusa de glucoproteina

p31
p24

POL
GAG

Endonucleasa
Protena central (core)

Doblete
Banda ancha

p17

GAG

Protena central

Banda ancha

Todas las bandas deben ser detectadas e interpretarse como Negativo, Positivo o Dudoso.
Interpretacion Negativo Negativo

Patron Ninguna banda virica especifica presente Deteccion de anticuerpos p17 unicamente

Deteccion de dos ENV y GAG o POL Deteccion de dos ENV y GAG o POL y banda especifica de VIH-2 visible

VIH-1 positivo VIH-1 positivo con VIH-2 sealado

Cualquier banda virica especifica Dudoso presente, pero el patro no cumple con los patrones de positivo Cualquier banda virica especifica presente ,pero el patron no cumple los criterios para positivo con una banda especifica de IH-2 visible Dudoso con VIH-2 sealado