Equipos 9 y 10

Es una tcnica de anlisis celular que permite medir caractersticas fsicas de los componentes y propiedades de una clula que fluyen en suspensin

 Identificar y enumerar subpoblaciones celulares nicas y definidas. Seleccionar y separar fsicamente subpoblaciones de clulas deseadas (por defleccin electrosttica ; esta tecnologa de separacin se llama "electronic cell sorting") Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas

 Se basa en hacer pasar una suspensin de partculas (generalmente clulas), las clulas pasan ordenadamente, y de una en una a una velocidad de 500 a 4000 clulas por segundo, por delante de un haz de lser focalizado, provocando alteraciones del haz de luz, que permite la medida simultnea de mltiples caractersticas fsicas de una sola clula.

 La mezcla de clulas teidas con diferentes fluorocromos es forzada a pasar a travs de una aguja creando una delgada fila de lquido que contiene las clulas. A medida que cada clula pasa en frente del lser, desva el rayo incidente y las molculas teidas unidas a la clula van a ser excitadas y emiten luz fluorescente. Tubos fotomultiplicadores detectan tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la informacin es digitalizada y procesada por el computador. Los resultados son presentados a manera de histogramas o "dot-plots

Diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por distintos detectores.

PARAMETROS Caractersticas Morfolgicas de la clula : tamao y complejidad del citoplasma Caractersticas antigenicas de la clula : Inmunofenotipo.

PARAMETROS FISICOS Su tamao relativo (forward scatter-FSC) Su granularidad relativa o complejidad interna ( side scatter SSC).
FLUORESCENCIA RELATIVA (FL1, FL2, FL3) Determinacin cuantitativa de caractersticas antignicas, bioqumicas y biofsicas de clulas individuales

 Unin de sitios especficos con anticuerpos marcados con fluorocromos El fluorocromo absorbe energa del lser El fluorocromo libera energa absorbida por : Vibracin y disipacin del calor. Emisin de fotones a una mayor longitud de onda llamada fluorescencia

 Marcadores fluorescentes de unin covalente: Isoticianato de Fluoresceina, Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas. Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de acrimina, yoduro de propidio, rh12. Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente . Pequeas molculas orgnicas (FITC, biotina): unin covalente directa con grupos amino libres en anticuerpos Protenas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a travs de algunos reactivos.

 Se hace en 3 etapas independientes :

1) Fase pre-citometra: preparacin de los reactivos, preparacin de las clulas, diseo del protocolo y coloracin de las clulas con los reactivos fluorescentes. 2) Fase de citometra de flujo : involucra el procesamiento de las clulas marcadas y la recoleccin de los datos para cada una de las medidas (parmetros) realizados en cada clula individual. 3) Fase de anlisis: anlisis de los datos recolectados

 Anlisis de un nmero estadsticamente significativo de clulas ( 1000 a ms de 100.000 clulas). Mltiples marcajes de una sola clula. Anlisis de alto numero de partculas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ). Alta sensibilidad y objetividad. Medidas separadas de cada clula (no slo el promedio). Medidas cuantitativas : discriminacin de las clulas segn la cantidad de marcador. Mltiples parmetros : define subpoblaciones complejas. Miles de clulas por segundo

 Poca informacin morfolgica de la clula No proporciona informacin de la localizacin celular en un tejido Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de clulas / hora) Necesita suspensin de clulas individuales. Costos de la tecnologa Mtodo destructivo. Incapacidad de visualizar las clulas que se analizan. Literatura recomendada

 Hematologa :tipificacion y conteo de clulas , reticulocitos y anlisis de medula sea . Farmacologa: estudios de cintica celular Inmunologa : subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular Oncologa : Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos Microbiologa : diagnostico bacteriano y virico, estudios de sensibilidad a los antibiticos Gentica : Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico prenatal.

 http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Cien cias/neurobioquimica/libros/celular/citometri a.htm http://www.youtube.com/watch?v=gEdZvuDr Wo4 (Video) http://www.cnb.csic.es/index.php/es/servicio s/citometria-de-flujo.html