DIAGNOSTICO DE Entamoeba histolytica Y E. dispar POR PCR EN MUESTRAS FECALES.

TECNICAS DE DIAGNOSTICO PARA ESPECIES DE ENTAMOEBA

MICROSCOPIA CULTIVO Y ANALISIS POR ISOENZIMA DETECCION DE ANTICUERPOS DETECCION DE ANTIGENOS ENSAYO INMUNOCROMATOGRAFICO DIAGNOSTICO BASADO EN DNA

MICROSCOPIA
LAS TECNICAS EMPLEADAS INCLUYE PREPARACION, CONCENTRACION Y TINCION PERMANENTE.

SOLUCIONES EMPLEADAS
Soluciones empleadas en procedimientos de concentracion Solucion de schaudinn Merthiolate yodo-formalina Acetato de sodio-acido acetico formalina (saf) Soluciones fijadoras permanentes Ziehl-nielsen Tincion de hierro-hematoxilina

CULTIVO Y ANALISIS POR ISOENZIMA

Medios Xenicos
Crecimiento del parasito en presencia de flora indefinida

Y Axenico
Cultivo de parasito sin ninguna otra clula presente.

 Un zimodemo es un grupo de cepas de amiba que muestran el mismo patron electrofortico para algunas enzimas Enzima malica, hexocinasa, glucosa fosfato isomerasa, y fosfoglucomutasa.

DETECCION DE ANTICUERPOS
Se emplea en paises industrializados donde la infeccion por E. histolytica no es comn. Se emplean en el diagnostico en areas endemicas donde la exposicion e E. histolytica se mantiene por un tiempo prolongado. Es importante en los casos de diagnostico de absceso heptico amibiano (ALA), cuando no se encuetran parasitos en heces.

DETECCION DE ANTGENOS
Se han desarrollado kits ELISAs para la deteccion de antgenos en muestras fecales. Existen kits que emplean: Anticuerpos monoclonales contra la lectina de E. histolytica Gal/GalNac. Anticuerpos monoclonales contra antgenos ricos en serina de E. histolytica. Anticuerpos monoclonales contra antgenos de superficie ricos en lectina. Anticuerpos contra lipofosfoglicano Anticuerpos contra una lectina de adherencia de 170 kD, detectada en saliva

Ventajas rapidez en la deteccion de E. histolytica/E. dispar. De facil realizacion. Mas sensible que la determinacion por microscopa y cultivo - Se encuentran disponibles varias marcas comerciales - No se requiere de personal altamente especializado para la realizacion de estas pruebas en algunos de los kits desarrollados

 Desventajas - Se desnaturalizan los antigenos de superficie cuando se fijan las muestras fecales. - Se requieren muestras frescas o congeladas - No diferencan entra las especies E. histolytica/E. dispar./E. moshkovskii

RESULTADOS FINALES

DIAGNOSTICO DE E. histolytica y E.dispar por PCR.

Fue desarrollado un ensayo de PCR de paso sencillo para detectar y diferenciar las tres especies de Entamoeba encontradas en el ser humano: E. histolytica, E. dispar y E. moshkovskii, las cuales son morfologicamente iguales en trofozoito y en quiste. Un primer forward conservado fue derivado de la mitad de la subunidad pequea del gen de rRNA, y el primer Reverse fue diseado a partir de secuencias especificas para cada una de esas especies EL PCR genero los siguientes amplificados: E. histolytica 166 bp E.dispar 752 bp E. moshkovskii 580 bp Por cuestiones de importancia en la incidencia de la poblacion analizada, solo se realiz diagnostico de E. dispar y E. histolytica

 RESULTADOS FINALES PRIMER ENVIO

16, 9%

, 0% 3, 2% E. histolytica E. dispar E. moshkovskii NEGATIVO

166, 89%

Amplificacin por PCR de DNA obtenido de heces fecales utilizando primers Especficos para cada especie de Entamoeba 6 7

1
Muestras 1.- muestra 1 2. 2 3. 3 4. 4 5. 5 622 527 404 307 242

5 Control positivo
6.- DNA E.dispar

7.-DNA E.histolytica

MUESTRA 1 2 3 5

E. histolytica POS POS POS POS

E. dispar NEG NEG NEG NEG

6 7 8 9 E.d E.h

QUIRARE TOMA1

10 Ed. Eh.

MUESTRA S RACK1 E. histolytica

6 7 8 9 10 POS POS POS POS POS

E. dispar
NEG NEG NEG NEG NEG

301 302 304 305 306 + +

622 527 404 307 242

Control

Positivo DNA E. histolytica

SEHUERACHI TOMA 1
MUESTRAS RACK 2 301 302 POS POS NEG NEG E. histolytica E. dispar

304
305 306

POS
POS POS

NEG
NEG NEG

TODOS LOS RESULTADOS EN ESTA CORRIDA FUERON NEGATIVOS

SEHUERACHI TOMA 1
MUESTRAS 260 262 263 264 265 266 267 268 270 271 273 274 275 276 277 E.histolytica NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG E. dispar NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

278
279 280 281 282 283

NEG
NEG NEG NEG NEG NEG

NEG
NEG NEG NEG NEG NEG

285 286 287 E.h

Ed.

TODOS LOS RESULTADOS EN ESTA CORRIDA FUERON NEGATIVOS

SEHUERACHI TOMA 1
MUESTRAS 285 286 287 E.histolytica NEG NEG NEG E. dispar NEG NEG NEG

56 57 84 85 86 88 92 93 95 Eh Ed. Agua

TODOS LOS RESULTADOS EN ESTA CORRIDA FUERON NEGATIVOS

SEHUERACHI TOMA 1 MUESTRAS E.histolytica E. dispar

86

NEG

NEG

88
92

NEG
NEG

NEG
NEG

93
95

NEG
NEG

NEG
NEG

QUIRARE TOMA 1
56 NEG NEG

57

NEG

NEG

253 260 262 263 264 265 266 267 268 E.h Ed Agua

270 271 273 274 275 276 277 278 279 E.h Ed Agua

LOS RESULTADOS FUERON NEGATIVOS

SEHUERACHI TOMA 1 MUESTRAS E.histolytica E. dispar

SEHUERACHI TOMA 1 MUESTRAS E.histolytica 271 273 NEG NEG E. dispar NEG NEG

253
260 262 263 264 265 266 267 268 270

NEG
NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

NEG
NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

274
275

NEG
NEG

NEG
NEG

276
277 278 279

NEG
NEG NEG NEG

NEG
NEG NEG NEG

282 283 284 285 286 287 288 289 290 292 E.h Ed.

293 296 297 298 299 300 303 307 308 294 E.h Ed

TODOS LOS RESULTADOS EN ESTA CORRIDA FUERON NEGATIVOS

SEHUERACHI TOMA 1
MUESTRAS E.histolytica 282 283 284 285 286 287 288 289 290 292 293 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG E. dispar NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

SEHUERACHI TOMA 1
MUESTRAS E.histolytica E. dispar

296 297
298 299 300 303 307 308 294

NEG NEG
NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

NEG NEG
NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

309 310 311 312 313 314 315 316 317 E.h Ed. Agua

318 319 320 321 322 323 324 325 328 E.h Ed. Agua

TODOS LOS RESULTADOS EN ESTA CORRIDA FUERON NEGATIVOS

SEHUERACHI TOMA 1 MUESTRAS E.histolytica E. dispar

SEHUERACHI TOMA 1 MUESTRAS E.histolytica E. dispar

309
310

NEG
NEG

NEG
NEG

318
319

NEG
NEG

NEG
NEG

311
312 313 314 315 316 317

NEG
NEG NEG NEG NEG NEG NEG

NEG
NEG NEG NEG NEG NEG NEG

320
321 322 323 324 325 328

NEG
NEG NEG NEG NEG NEG NEG

NEG
NEG NEG NEG NEG NEG NEG

332 333

Eh. Ed. Agua

SEHUERACHI TOMA 1
MUESTRAS 332 333 E.histolytica NEG NEG E. dispar NEG NEG

347 348 349 352 353 354 356 357 359 E.h E.h Agua

360 269 334 335 336 337 339 340 341 E.h E.h Agua

SEHUERACHI TOMA 1

SEHUERACHI TOMA 1

MUESTRAS E.histolytica
347 348 349 352 353 354 356 357 359 NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

E. dispar
NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG NEG

MUESTRAS

E.histolytica

E. dispar

360
369 334 335

NEG
NEG NEG NEG

NEG
NEG NEG NEG

336
337 339 340 341

NEG
NEG NEG NEG NEG

NEG
NEG NEG NEG NEG

342 343 344 345 346 Eh. Ed. Agua

SEHUERACHI TOMA 1 MUESTRAS 342 343 344 345 346 E.histolytica NEG NEG NEG NEG NEG E. dispar NEG NEG NEG NEG NEG

 Del Segundo Envio solo se procesaron las muestras que dieron positivo en el Primer envio. Las muestras no tenian el albergue de procedencia, por lo cual solo se identificaron a travs del numero. Muestras positivas para E. histolytica

 Se analizaron esta vez solo 20 muestras de las cuales fueron 3 positivas para E. histolytica y ninguna para E. dispar
RESULTADOS EL SEGUNDO ENVIO

E. histolytica, 4, 19% E. dispar, 0, 0% E. histolytica , 0, 0% E. dispar

NEGATIVO, 17, 81%

NEGATIVO

10 13

E.h E.d Agua

MUESTRA

E. histolytica

E. dispar

POS

NEG

POS

NEG

54 301 302 306 307 324 325 Eh. Ed. Agua

PRIMERA TOMA

TOTAL MUESTRAS ANALIZADAS 185

100 % Producto de Amplificacion SEGUNDA TOMA TOTAL MUESTRAS ANALIZADAS 21 100 % Producto de Amplificacion

E. histolytica 16
9% 166 bp

E. dispar E. moshkovskii 0 3
0% 752 bp 2% 580 bp

NEGATIVO
166 89 %

E. histolytica 4 19 % 166 bp

E. dispar 0 0% 752 bp

NEGATIVO 17 81 % 580 bp