Atividade AntiComplemento na Saliva de Flebotomneos e outros Insetos Hematfagos

A Saliva de Insetos Hematfagos

Estudada e utilizada para fins medicamentosos: sanguessugas e sangrias; restabelecimento da microcirculao.
Protenas da saliva do inseto desencadeiam defesa imunolgica localizada Clulas de defesa liberam histamina Inflamao: pele vermelha e coceira

Inseto morde

Particularidades da Saliva de Alguns Animais Hematfagos:

Sanguessugas: conseguem parasitar o hospedeiro por horas sem que haja coagulao do sangue hirudina - liga-se trombina Carrapatos: conseguem driblar o sistema imune. protenas na saliva que se ligam histamina Flebotomneos: alimentam-se o suficiente por pouco tempo. ao morder o hospedeiro, o inseto secreta substncias vaso dilatadoras. O hospedeiro ficar ciente do parasita em poucos segundos.

PARASITA

TIPO DE DROGA

PODERIA SER USADA PARA...

Sanguessuga

Diminui a viscosidade do sangue

Preveno da coagulao do sangue aps cirurgias.

Carrapato

Anti-inflamatrios

Tratamento de conjuntivite, asma.

Flebotomneos

Vacinas

Preveno da leishmaniose.

Sistema do Complemento
um dos principais efetores da imunidade humoral,
importante mecanismo efetor da imunidade inata, so protenas plasmticas e de superfcies celulares que se interagem entre si e com algumas clulas de modo altamente regulado, as duas principais vias de ativao so a Via Clssica e Via Alternativa.

A Via Clssica
ativada por certos isotipos de anticorpos ligados a antgenos. iniciada pela ligao da protena C1 do complemento nos domnios CH2 das molculas de IgG ou dos domnios CH3 das molculas de IgM ligadas a antgenos.

A Via Alternativa
ativada nas superfcies das clulas dos microrganismos. Resulta na protelise de C3 e na insero de seu produto de degradao C3b s superfcies microbianas, sem o papel de anticorpo.

A Via Comum

Funes do Complemento opsonizao e

fagocitose,

estimulao das respostas inflamatrias,

citlise mediada pelo complemento.

Ensaio da Ao Salivria nas Vias Clssica e/ou Comum da Cascata do Complemento

Objetivo
estudo da cascada do complemento pela ativao da via clssica, mantendo a via alternativa inativada. Metodologia 1) Opsonizao de eritrcitos de ovelha: Opsonizao com anticorpos anti-eritrcitos de ovelha

2) Hemlise e leitura: a) b) c) d) e) f) 50l de soro humano foi diludo em GBH+ adio de 25l de soluo de saliva; eritrcitos sensibilizados; centrifugao (1700 g por 30s); transferncia de 200l do sobrenadante para uma placa de ELISA; medio das hemlises: Total Espontnea Na presena do complemento sem saliva

Resultados: Lu. longipalpis - curva de inibio da via clssica do complemento sigmoidal.

Lu. migonei - grfico de inibio da via clssica do complemento apresenta padro retilneo.
Triatomneos

Discusso: Diferena poderia estar relacionada com a ao de molculas inibitrias da saliva destes insetos.

Ensaio da ao de saliva na via alternativa e/ou comum na cascata do complemento

Preparao dos eritrcitos de coelho: -eritrcito lavado 3x em GHB EDTA -armazenado a 4C por uma semana -dia do experimento: lava-se os eritrcitos 3x Mg EGTA Ensaio: -soro humano (50 ml) diludo em Mg EGTA 90% hemlise -25 ml de saliva (procedimento idntico ao descrito no ensaio da via clssica)

Procura por hemolisina na saliva de flebotomnio -protocolo da via clssica: soro humano foi substitudo por soluo salina

-usado 20 lobos de glndula salivar em cada teste -Lu. longipalpis e Lu. migonei

Resultados
Teste da inibio da via alternativa do sistema do complemento: + Lu. longipalpis - Lu. migonei Ausncia de hemolisina, nas duas espcies, que poderia interferir no ensaio (a maior concentrao usada foi incapaz de provocar hemlise)

Discusso

A saliva de Lu. longipalpis tem aproximadamente a mesma potncia de inibir tanto a via clssica quanto a alternativa do sistema do complemento, desde que a taxa entre as quantidades (requerida para promover 100% de inibio). de soro e saliva nos ensaios seja a mesma
A saliva de alguns insetos interfere no sistema do complemento

poderia explicar a transmisso de Leishmania por insetos

Caracterizao da natureza qumica do fator inibitrio da Via Clssica

1. Ensaio da inativao por aquecimento:
incubao da saliva de Lu. longipalpis em banho maria (~100C) por 10, 30 e 60 min. Aps isso, foram realizados ensaios de hemlise pela Via Clssica.

2. Ensaio de digesto pela proteinase K: uma amostra

de saliva foi incubada com proteinase K. Aps a incubao e diluio com soro fetal bovino foi realizado ensaio de hemlise pela Via Clssica.

3. Avaliao do peso molecular do fator inibitrio da Via Clssica: ultrafiltragem de saliva em membranas
cujo limite de corte era de 30.000, 10.000, e 5.000Da. Aps isso foi realizado ensaio de hemlise pela Via Clssica com as trs amostras de saliva ultracentrifugada.

Resultados: a saliva incubada com proteinase K perde sua atividade inibitria trata-se de uma protena. trata-se de uma protena de peso molecular entre 10 30kDa.

fator inibitrio do complemento bastante termoestvel, pois resiste por mais de 1 hora a 100C sem perder sua funo provavelmente apresenta alto nmero de pontes dissulfeto entre resduos de cistena.

Ensaio da Inibio da Tripsina por Saliva de

Lu. longipalpis
Ensaio:

Tripsina de porco Tampo HEPES / HCl Saliva Substrato (BApNA) Medio por densidade ptica Resultados: Quantidade de saliva correspondente a 100 glndulas no inibe a atividade da tripsina

Ao do Soro Anti-saliva de Lu. longipalpis no Efeito Inibitrio da Saliva do Inseto na Via Clssica do Complemento
Ensaio: Imunizao dos hamsters com Lu longipalpis Coleta de sangue dos hamsters Inativao do soro dos animais Ensaio de hemlise Mistura da saliva com anticorpos Adio do complemento

Resultados: O soro anti-saliva no inativou significativamente a atividade inibitria da saliva de Lu. longipalpis na via clssica do complemento.

Discusso: Anticorpos da saliva de Lu longipalpis foram incapazes de inativar totalmente a atividade do inibidor do complemento. Baixa eficincia pode estar relacionada a propriedades imunossupressoras da saliva do flebotomneo.

A protena inibitria da via clssica e alternativa

poderia fazer parte da composio de uma vacina dirigida contra algum componente imunomodulatrio da saliva de Lu. longipalpis e outros flebotomnios.

Referncias Bibliogrficas: CAVALCANTE, R. R., PEREIRA, M. H., GONTIJO, N. F. Anti-

complement activity in the saliva of phlebotomine sand flies and outher haematophagous insects. Parasitology (2003) 127, 87 93. CLAYTON, J. Wanted: bloodsuckers. NewScientist 13 de julho de 2002, 42 45. ABBAS, A . K., LICHTMAN, A . H., POBER, J. S. Imunologia Celular e Molecular, Quarta Edio, Editora Revinter, 2003.

Ana Cristina Munhoz; Marcela Oliveira Faria;

Patrcia Rosa de Arajo;

Paula Fernandes dos Santos; Raquel Coelho Loures Fontes.

Cincias Biolgicas UFMG.