Enzimas de Restrio

Tpicos a abordar
Diferentes tipos de enzimas de restrio (tipo I, II, III)

Enzimas do tipo II e sequncias de reconhecimento (4, 6, 8 nts)

Izosquizmeros e enzimas compatveis Hidrlises mltiplas

Aplicaes em engenharia gentica

Mapas de Restrio

Nota Histrica
1950 1956
1940 1953 1966 1970 1978 1972 2006

~1940 Experincias com bacterifagos 1972 Primeiras experincias com DNA recombinante (Berg & Boyer) ~1950 Isolamento Diferenteseeficcias de infeces parte dos 1978 caracterizao de mais por de 200 bacterifagos. Variaes entre estirpes bacterianas. enzimas de restrio

1953 Prmio Estrutura doDNA (Watson Crick)e D. Nathans Nobel W. Arber, H. Smith 1956 Isolamento da DNA polimerase (Kornberg) 1966 Isolamento da DNA ligase (Weiss & Richardson)
1970 Purifica-se a primeira enzimainde restrio tipo II: o educar.sc.usp.br Hind II (Smith & Wilcox)

Enzimas de restrio
Protenas que reconhecem e clivam o DNA em pontos especficos, geralmente em sequncias de 4, 6 e 8 bases - palndromas

in educar.sc.usp.br

Enzimas de restrio
Enzimas produzidas por bactrias para restringir a proliferao de vrus invasores

Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequncias de

bases de DNA

Ajuda

detectar

presena

de

diferentes

formas

de

determinados genes

in 1fiuA-1crf_-active

Nomenclatura
As enzimas de restrio so chamadas de acordo com a bactria que a produziu Exemplo: EcoR I
Gnero Ordem de descoberta

Estirpe

Espcie

Escherichia

coli RY 13

1 enzima a ser descoberta nesta bactria

Sistemas de Restrio - Modificao

Mecanismo de defesa presente quando da entrada de DNA fgico

na clula
Combinao de enzimas de restrio com metilases
hidrlise do DNA estranho proteco do DNA celular relativamente as enzimas de restrio atravs da adio de grupos metil s bases A ou C

DNA metilase possui a mesma sequncia de reconhecimento que os enzimas de restrio

Existem raras excees em que a metilao pode provocar a activao do enzima de restrio

Sequncias de reconhecimento
No ambguas Exemplo: BamHI - s reconhece a sequncia GGATCC CCTAGG Ambguas Exemplo: HInf I - reconhece sequncias de 5bp comeadas por GA e que terminem em TC

Tipos de enzimas de restrio

Classificao baseada em:
Composio da sequncia nucleotdica Posio de clivagem Sequncia de reconhecimento Co-fatores envolvidos Estrutura da enzima em causa

in Lenhinger Principles of Biochemistry

Tipos de enzimas de restrio

Tipo I
3 subunidades: 1 subunidade de restrio (R)

1 subunidade de metilao (M)

1 subunidade de reconhecimento (S) Sequncia de reconhecimento assimtrica

Local de hidrlise no especfico e ocorre a mais de 1000 bp de distncia

Hidrlise sempre num local diferente e necessita de ATP

Impede o seu uso em engenheira gentica

Tipo III
2 subunidades: 1 subunidade de restrio (R) 1 subunidade de metilao e reconhecimento (MS) Sequncia de reconhecimento assimtrica (5-7 bp) Dupla cadeia de DNA hemimetilada Local de hidrlise a mais de 24-26 bp de distncia Hidrlise sempre num local diferente e necessita de ATP

Impede o seu uso em engenheira gentica

Tipo II
Duas enzimas: 1 enzima de restrio (Endonuclease)

1 enzima de metilao (Metilase)

Estrutura com 4 folhas e 1 hlice Sequncia de reconhecimento palindrmica 4-8nts

Hidrlise ocorre dentro ou nas extremidades da sequncia

reconhecida No necessita de ATP, apenas Mg2+

Importantes na recombinao gentica e na elaborao de mapas de restrio (especificidade de corte)

Izosquizmeros
Diferentes enzimas de restrio que possuem a mesma sequncia de reconhecimento Diferem nas condies timas de reao, na estabilidade
Exemplo:
Enzimas de restrio
SacI

Sequncia de reconhecimento
GAGCTC CTCGAG

SstI

GAGCTC CTCGAG

Enzimas compatveis
DNA recombinado com sequncia hbrida

Sobreposio parcial de sequncias de reconhecimento

Produzem extremidades protuberantes compatveis
Exemplo: Enzimas de restrio
BamHI

Sequncia de reconhecimento
GGATCC CCTAGG

BglII

AGATCT TCTAGA

Factores que influenciam a atividade das enzimas de restrio:

Composio do tampo
Diferem na fora inica (concentrao de sal) Diferem no catio principal (Na+ ou K+) Soluo: Manter o pH da reaco (geralmente em 8.0)

Temperatura de incubao
A maioria das enzimas cliva melhor a 37C Excepes: Bactrias termoflicas clivam melhor entre 50 a 60C Enzimas com tempo de meia vida pequeno a 37C, recomenda-se a incubao a 20C

Influncia da metilao no DNA

Existe algumas endonucleases de restrio que no clivam DNA metilado

Digesto com mltiplas enzimas

Hidrlise Enzimtica
As endonucleases de restrio do tipo II ligam-se ao sulco maior da forma b-DNA

Dois tipos de ligao: no especfica e especfica

A ligao no especfica permite enzima deslizar pela cadeia ligada apenas ao backbone da molcula de DNA A ligao especfica leva alterao da dupla hlice de DNA, para aproximar melhor as bases dos centros catalticos A metilao de uma base impede a ligao especfica e a formao do complexo

Hidrlise Enzimtica
A hidrlise d-se ao nvel das ligaes fosfodister Mg2+ um cofator essencial, mas pode ser substitudo por certos ctions divalentes, como Mn2+
5

Produtos da hidrlise resultam em extremidades 3-OH e 5-P

Hidrlise Enzimtica
A cadeia de DNA pode ser hidrolisada para dar origem a pontas cegas (blunt ends) ou pontas coesivas (sticky ends) Duas cadeias com pontas cegas podem ser unidas por uma DNA-ligase, mesmo sendo de origens diferentes

Uma cadeia com pontas coesivas liga-se com maior facilidade a cadeias com sequncias complementares

Hidrlise Enzimtica
Extremidade cega (blunt ends)
Clivam as duas cadeias de DNA em ligaes fosfodister opostas

Extremidade coesiva (sticky ends)

Clivagem assimtrica DNA nas cadeias de

Pequeno nmero de nucleotdeos em cadeia simples, capazes de se associar por ligaes de hidrognio, com outra cadeia simples em que a sequncia de bases seja complementar desta (annealing)

Hidrlise Enzimtica
A hidrlise enzimtica pode ser simples ou mltipla dependendo do nmero de enzimas utilizadas na obteno de fragmentos de DNA

Hidrlise simples: Digesto do DNA com uma nica enzima de restrio Determinao relativa das orientaes dos fragmentos no DNA linear

Hidrlise mltipla: DNA hidrolisado por mais que uma enzima de restrio Determinao das posies dos fragmentos no DNA, produzidos pelas enzimas, com a ajuda da eletroforese

Aplicaes em Engenharia Gentica

O termo engenharia gentica inclui:
mtodos para a formao de combinaes novas do material gentico introduo e replicao do DNA recombinante numa bactria para amplificar o gene

Clonagem de Genes
Anlise molecular da estrutura do cromossomo e do genoma (mapeamento, o grau de metilao)
Caracterizao fenotpica (manifestos ou latentes) de defeitos genticos hereditrios ao nvel do DNA (RFLPs) Relacionamentos filogenticos pela comparao de locais selecionados da restrio em genes essenciais.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Marcador de DNA

Mutaes em 2 alelos especficos de cada individuo em locais de restrio polimorfismo:

sequncias diferentes de restrio
diferentes tamanhos de fragmentos

Muitas doenas humanas prejudiciais ou fatais caem nesta categoria

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Testes padres do DNA das pessoas com doena Testes padres do DNA de pessoas saudveis (controlo)

Banda igual Banda igual Banda comum em pessoas com doena

Banda comum em pessoas saudveis

A existncia de RFLPs fornece a base para estabelecer relacionamentos inequvocos de paternidade

Mapas de Restrio
uma compilao do nmero, da ordem e da distncia entre locais do corte do enzima de restrio ao longo de um segmento clonado do DNA
As unidades do mapa so expressadas em pares de bases ou para distncias mais longas em pares de kilobases
O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vector bem caracterizado do plasmdeo ou do bacterifago, onde a sequncia conhecida

Normalmente, o mapeamento a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido e um pr-requisito a manipul-lo para outras finalidades.

Elaborao de Mapas de Restrio

Existem dois mtodos para elaborar um mapa de restrio: mapeamento utilizando digestes mltiplas mapeamento utilizando digestes parciais

Construo de mapas de restrio com hidrlises mltiplas: Hidrlise do DNA: separadamente com hidrlises simples e com pares de enzima Aplicar uma electroforese em gel para os fragmentos obtidos
(Permite a separao dos fragmentos gerados de diferentes tamanhos!!!)

Elaborao de Mapas de Restrio

0.8 0.4

5.8

10.0 8.0 7.0 6.2 5.8 5.0 2.5 1.2 1.0 0.5 0.8 0.8 0.4 5.8

0.8 1.2 HindIII SalI

7.0

Modelo I

0.8

5.0

1.2

0.8 HindIII

Modelo II

5.8 SalI

7.0

Mapas de Restrio
Digesto Parcial com marcao radioativa (32P) dos extremos do DNA
Fragmento de DNA marcado num dos extremos com um radioistopo

Pode ser parcialmente digerido com enzimas de restrio produzindo fragmentos marcados de tamanhos diferentes mas que revelam directamente onde so os locais de clivagem Digesto parcial surge em condies no timas para que ocorram um nmero limitado de hidrlises:

perodo de incubao pequeno

incubao a baixas temperaturas

Elaborao de Mapas de Restrio

Enzimas XbaI XhoI N de fragmentos 2 2 Tamanho / kd 24.0, 24.5 15.0, 33.5

KpnI
XbaI + XhoI XbaI + KpnI

3
3 4

1.5, 17.0, 30.0

9.0, 15.0, 24.5 1.5, 6.0, 17.0, 24.0

linear Tamanho do fragmento: 48.5 kd

N de stios restries de:

XbaI 1

XhoI 1

KpnI 2

Elaborao de Mapas de Restrio

XbaI
XhoI XbaI + XhoI

24.0, 24.5
15.0, 33.5 9.0, 15.0, 24.5

XhoI XhoI

XbaI

9.015.0 24.0

15.09.0

24.5

48.5

Todos os locais de restrio do KpnI caem no fragmento da XbaI 24.5 kb, uma vez que o fragmento 24.0 kb continua intacto aps a digesto dupla do XbaI-KpnI A ordem dos fragmentos do KpnI s pode ser determinado pela digesto parcial

Elaborao de Mapas de Restrio

Enzima
KpnI digesto parcial XbaI + KpnI

Tamanho / kd
1.5, 17.0, 18.5, 30.0, 31.5, 48.5 1.5, 6.0, 17.0, 24.0

Os fragmentos 1.5, 17.0 e 30.0kd so produtos da digesto completa Os fragmentos 18.5 e 31.5kd so produtos da digesto parcial XhoI XbaI Kpn I Is Kpn

15.0

9.0

6.0

1.524.5 17.0 18.5 17.0

1.5 48.5

Elaborao de Mapas de Restrio

EcoRI
12.0

BamHI
12.0

HindIII
12.0

HaeII
6.0 4.0 2.0

EcoRI + HaeII 5.0 4.0 2.0 1.0

BamHI + HaeII 6.0 4.0 1.5 0.5

HindIII + HaeII 6.0 2.5 2.0 1.5

EcoRI + HindIII 6.5 5.5

EcoRI + BamHI 10.5 1.5

BamHI + HindIII 8.0 4.0

BamHI HaeII (0/12.0)

(11.5)

EcoRI
(1.0)

circular Tamanho: 12.0kd

HaeII
(10.0)

12.0kd

HindIII
(7.5)

HaeII (6.0)

Elaborao de Mapas de Restrio

Elaborao de Mapas de Restrio

Elaborao de Mapas de Restrio

RAPD: randomly amplified polymorphic DNA

Size sorted

RAPD: randomly amplified polymorphic DNA

B

AFLP: amplified fragment length polymorphism

Digesto do DNA com 2 enzimas Ligao de adaptadores nos finais dos fragmentos PCR com primers adaptadores dos fragmentos

AFLP

VNTR: variable number tandem repeats

Regies no codificadoras

Muitas cpias de uma mesma sequncia no genoma

Alta taxa de variao entre indivduos no nmero de cpias

Microssatlites
VNTRs mais utilizados Repeties de 2, 3, ou 4 pares de bases Prximo de 100 cpias aleatrias de cada Altamente varivel Muitos loci diferentes de microssatlites (1000s) em diferentes espcies

Microssatlites

Microssatlites

Bibliografia
Brown, T.A. (1998) Gene Cloning an introduction 3rd ed., Santley Thorner (Publishers) ltd, Manchester, UK Kulg; Cunnings (1997) Concepts of Genetics 5th ed., Internacional edition, Prentice Hall, USA

Watson, James D. (1992) Molecular Biology of the Gene 3rd ed., Benjamin/Lumming, Harvard University and Cold spring Haba laboratory
Lewin, Benjamin (1997) Genes VI Oxford University Press, Oxford, New York Gerhartz Wolfgang (1990) Enzymes in Industry Production and Applications VCH, New York