AKTIVITAS KOMBINASI EKSTRAK TEMULAWAK, KUNYIT DAN JAHE MERAH SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI 5-FLUOROURACIL PADA SEL KANKER

KOLON WiDr

diajukan oleh : YESSY KHOIRIYANI G1F010008 kepada UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN JURUSAN FARMASI PURWOKERTO 2013 Pembimbing: 1. Sarmoko, M. Sc., Apt. 2. Heny Ekowati, M. Sc., Apt. Penguji : 1. Esti Dyah Utami, M. Sc., Apt. 2. Eka Prasasti Nur Rachmani, M. Sc., Apt.

KANKER KOLON 1. Di Indonesia, kanker merupakan penyebab kematian nomor tiga setelah penyakit jantung dan stroke (Zain et al., 2007). Salah satu jenis kanker yang memiliki prevalensi tinggi yaitu kanker kolon

5-Fluorouracil (5-FU) merupakan agen kemoterapi utama yang digunakan untuk terapi kanker kolon tetapi efektivitasnya baru mencapai 15% sehingga diperlukan pengembangan agen ko-kemoterapi untuk meningkatkan efektivitas terapi dengan 5-FU (Meyerhardt and Mayer, 2005).

Latar Belakang
Temulawak, kunyit dan jahe merah memiliki aktivitas sabagai antikanker.

2. Berdasarkan data
kematian akibat kanker kolon lebih dari 33% pada tahun 2008 (Ries et al., 2007)

National Cancer Institute, angka

Agen kokemoterapi yang meningkatkan efektivitas melalui peningkatan efek sitotoksik

Perumusan Masalah

1 2 3

Apakah kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C.longa dan Z.officinale cv. Rubrum mempunyai aktivitas sitotoksik pada sel kanker kolon WiDr yang dinyatakan dengan IC50 ?

Apakah

sitotoksik dari kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C.longa dan Z.officinale cv. Rubrum lebih baik dibandingkan dengan ekstrak tunggalnya pada sel kanker kolon WiDr yang dinyatakan dengan IC50?

aktivitas

Apakah kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C.longa dan Z.officinale cv. Rubrum memiliki efek sinergis dengan 5Fluorouracil sebagai agen ko-kemoterapi melalui peningkatan efek sitotoksik?

Tujuan Penelitian
1
2 3
Menguji aktivitas sitotoksik kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C. longa dan Z.officinale cv. Rubrum pada sel kanker kolon WiDr yang dinyatakan dengan IC50.

Menguji aktivitas sitotoksik kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C. longa dan Z.officinale cv. Rubrum dibandingkan dengan ekstrak tunggalnya pada sel kanker kolon WiDr yang dinyatakan dengan IC50.

Mengetahui efek sinergisme kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C.longa dan Z.officinale cv. Rubrum dengan 5-Fluorouracil sebagai agen ko-kemoterapi melalui peningkatan efek sitotoksik.

Manfaat Penelitian

1 2 3

Memberikan informasi ilmiah mengenai aktivitas sitotoksik dari kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C.longa dan Z.officinale cv. Rubrum sebagai antikanker pada sel kanker kolon WiDr.

Memberikan informasi ilmiah mengenai aktivitas sitotoksik dari kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C.longa dan Z.officinale cv. Rubrum dibandingkan dengan ekstrak tunggalnya sebagai antikanker pada sel kanker kolon WiDr. Meningkatkan kegunaan kombinasi ekstrak C.xanthorrhiza, C.longa dan Z.officinale cv. Rubrum sebagai bahan obat-obatan alami sebagai agen ko-kemoterapi 5-Fluorouracil dalam pengobatan kanker kolon.

Keaslian Penelitian
Ekowati et al. (2012)
Aktivitas sitotoksik Zingiber officinale, Piper retrofractum dan kombinasi keduanya terhadap sel myeloma diperoleh IC50 berturut-turut 28, 36 dan 55 g/ml. Zingiber officinale, Piper retrofractum dan kombinasi keduanya dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker WiDr dengan nilai IC50 Zingiber officinale, Piper retrofractum dan kombinasi keduanya berturut-turut 74, 158 dan 64 g/ml.

Kurapati (2012)
Kombinasi ekstrak C.longa dan Z.officinale memiliki efek sitotoksik lebih besar pada cell line kanker prostat PC-3M.

Milacic et al. (2009)

Kurkumin pada C.longa memiliki kemampuan untuk menghambat proteasome dan menginduksi apoptosis pada sel kanker kolon HCT-116 dan SW 480.

Chintana (2008)
Kurkumin pada C. longa dan C. xanthorrhiza efektif menghambat proliferasi sel kanker melalui induksi apoptosis dengan mempengaruhi ekspresi cyclooxygenase-2 (COX-2) dan vascular endhothelial growth factor (VEGF) sebagai angiogenic biomarker pada kanker.

Cheah et al. (2006)

Xanthorrhizol yang terkandung dalam C. xanthorrhiza mampu mencegah terjadinya inflamasi, karsinogenesis dan metastasis melalui penghambatan COX-2 juga menginduksi terjadinya sitotoksik dan apoptosis pada sel MCF-7.

Biologi Kanker
Kanker merupakan suatu penyakit sel yang ditandai dengan hilangnya fungsi kontrol sel terhadap regulasi daur sel maupun fungsi homeostatis sel pada organisme multiseluler. Salah satu penyebab perubahan ini adalah terpejannya sel normal oleh zat-zat karsinogen, diantaranya senyawa-senyawa kimia, fisik dan biologis (Balmer et al., 2005).

Mutasi yang terjadi pada DNA di dalam gen yang meregulasi siklus sel (pertumbuhan, kematian dan pemeliharaan sel) akan menyebabkan penyimpangan siklus sel, dan salah satu akibatnya adalah pembentukan kanker atau karsinogenesis. Proses karsinogenesis secara bertahap diawali dengan proses inisiasi, dilanjutkan dengan promosi dan berlanjut dengan progresi dari sel normal menjadi sel kanker atau malignant cell (Aggarwal and Shishodia, 2006).

Kanker Kolon
Merupakan salah satu penyebab utama dari kematian akibat kanker di seluruh dunia. Disebabkan oleh hasil dari interaksi dari berbagai faktor seperti usia, riwayat penyakit dan gaya hidup (Tsai et al., 2010). Serta merupakan pertumbuhan sel yang bersifat ganas yang tumbuh pada kolon dan menginvasi jaringan di sekitarnya (Medina and Davis, 2005).

Terapi Kanker Kolon

Pengobatan dasar kanker kolon Pengangkatan tumor dan pembuluh limfe (pembedahan) dan sebagian besar penderita kanker kolon memerlukan kemoterapi.
The National Comprehensive Cancer Network (Anonim, 2005) memperkenalkan rejimen kemoterapi untuk terapi adjuvan kanker kolon .

Rejimen Kemoterapi Kanker Kolon

Stadium II
Tidak diberikan terapi , atau Mempertimbangka n pemberian 5fluorourasil (5-FU) dan leucovorin atau capecitabine atau regimen FOLFOX (5 Kanker telah mengalami metastasis ke kelenjar getah bening dan kelenjar limfe tetapi belum menyebar ke organ tubuh lain 5- fluorourasil (5FU) dan leucovorin atau capecitabine atau regimen FOLFOX (5-

Stadium IV
Kanker telah mengalami metastasis ke organ lain seperti hati dan paru-paru FOLFOX (5-

Sel abnormal tidak mengalami metastasis Tidak diberi rejimen kemoterapi

fluorourasil, leucovorin oxaliplatin)

dan

Stadium 0 dan I

fluorourasil, leucovorin dan oxaliplatin).

fluorourasil, leucovorin dan oxaliplatin)/Bevaci zumab.

Stadium III

Sel WiDr
Sel WiDr merupakan sel kanker kolon manusia yang diisolasi dari kolon seorang wanita berusia 78 tahun. Sel WiDr merupakan turunan sel kanker kolon yang lain yakni sel HT-29 (Chen et al., 1987).

Terjadi mutasi gen p53 yaitu terjadinya perubahan residu arginin menjadi histidin (Noguchi et al., 1979). Namun, p21 pada sel WiDr yang masih normal memungkinkan untuk terjadinya penghentian daur sel (Liu et al., 2006).

Agen Kemoterapi 5-FU

5-Fluorouracil (5-FU) agen kemoterapi utama untuk terapi kanker kolon. 5-FU adalah antimetabolit yang bekerja secara antagonis dengan timin terhadap aktivitas enzim timidilat sintetase (TS). Dibandingkan dengan agen kemoterapi yang lain, 5FU memiliki selektivitas yang tinggi pada aktivitas TS dan efek samping yang ditimbulkan relatif lebih ringan. Namun, efektivitas 5-FU sebagai agen kemoterapi baru mencapai 15% sehingga diperlukan pengembangan agen ko-kemoterapi untuk meningkatkan efektivitas terapi dengan 5-FU (Meyerhardt and Mayer, 2005).

Temulawak, Kunyit dan Jahe Merah

Temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.)
Temulawak mengandung senyawa zingiber, kurkumin, xanthorrizol, benzofuran dan minyak atsiri James and Mukhtar (2007), Mukherjee et al. (2007), dan Singh and Anggarwal (2010), menunjukan bahwa kurkumin bekerja dengan cara menghambat telomerase pada proses replikasi DNA pada sel kanker.

Kunyit (Curcuma longa L.)

Kunyit mengandung minyak asiri dengan senyawanya antara lain, sineol, borneol, zingiberene, curcumene Chintana (2008) menjelaskan bahwa kandungan kurkumin pada C. longa dan C. xanthorrhixa efektif menghambat proliferasi sel kanker melalui induksi apoptosis dengan mempengaruhi ekspresi cyclooxygenase-2 (COX-2) dan vascular endhothelial growth factor (VEGF) sebagai angiogenic biomarker pada kanker.

Jahe Merah (Zingiber officinale cv. Rubrum)

Kandungan aktif pada jahe merah yaitu gingerol, paradol, shogaol, zingerone, resin dan minyak atsiri Nigam et al. (2009) menjelaskan bahwa kandungan senyawa 6-gingerol dan 6paradol dalam Z. officinale mempengaruhi fase istirahat siklus sel dan induksi apoptosis sel kanker melalui peningkatan ekspresi gen p-53, Bax level, dan penurunan ekspresi gen Bcl-2.

Sitotoksik
Sitotoksik merupakan kemampuan suatu senyawa kimia untuk menghancurkan sel tertentu (Rode et al., 2004). Salah satu metode yang digunakan untuk uji sitotosik adalah MTT assay yang didasarkan pada aktivitas enzim yang dapat diukur secara kolorimetri. Pereaksi MTT merupakan garam tetrazolium yang dapat dipecah menjadi kristal formazan oleh sistem suksinat tetrazolium reduktase yang terdapat dalam jalur respirasi sel pada mitokondria yang aktif pada sel yang masih hidup.

Uji sitotoksik digunakan untuk menentukan parameter nilai IC50. Nilai IC50 dibawah 1000 g/mL menunjukkan adanya potensi ekstrak uji sebagai agen kemoprevensi.

Ko-Kemoterapi Kanker
Kombinasi kemoterapi (ko-kemoterapi) merupakan strategi terapi dengan mengkombinasikan suatu senyawa dengan agen kemoterapi. Kombinasi kemoterapi bertujuan untuk meningkatkan efektivitas pengobatan dan menurunkan efek samping agen kemoterapi.

Metode yang umum digunakan untuk mengevaluasi kombinasi obat adalah Isobologram dan Combination Index (CI). Analisis CI menghasilkan suatu nilai parameter kuantitatif yang menggambarkan efikasi kombinasi

Landasan Teori
Katzung (2004) obat antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Pengobatan kanker secara tradisional diharapkan dapat menurunkan toksisitas dan efek samping.

Beberapa penelitian menunjukkan bahwa penggabungan tanaman dapat meningkatkan efektivitas karena kombinasi tersebut memiliki mekanisme yang saling mendukung dengan efek samping minimal (Beinfield and Kornglod, 2005).

Hipotesis
Ekstrak C.xanthorrhiza, C.longa dan Z.officinale cv. Rubrum memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker kolon WiDr dan kombinasinya memiliki aktivitas sitotoksik lebih baik dibanding ekstrak tunggalnya. Kombinasi ekstrak dapat meningkatkan efektivitas 5Fluorouracil sebagai agen kemoterapi melalui peningkatan efek sitotoksik.

Metode Penelitian
Penelitian dilaksanakan selama 6 bulan di Laboratorium Taksonomi Fakultas Biologi, Laboratorium Biologi Farmasi dan Laboratorium Riset Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto.
Waktu dan Tempat Penelitian

Neraca analitik, BSC, mikrokultur 96 , mikropipet, inkubator CO2, mikroskop inverted, ELISA reader,

camera digital.

Rimpang temulawak, kunyit dan jahe merah, etanol 96%, 5Fluorouracil, cell line WiDr, medium RPMI, FBS, PBS, yellow MTT.

Alat

Bahan

Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium. Penelitian dilakukan menggunakan ekstrak temulawak, kunyit dan jahe merah sebagai senyawa uji terhadap sel kanker kolon WiDr. Uji aktivitas sitotoksik dan uji ko-kemoterapi dilakukan dengan metode Yellow MTT assay.

Variabel bebas
konsentrasi kombinasi ekstrak temulawak, kunyit, jahe merah, kombinasi ketiga ekstrak dan 5-Fluorouracil.

Variabel terikat
Aktivitas sitotoksik yang dinyatakan dengan IC50 (nilai konsentrasi yang menghasilkan penghambatan jumlah sel kanker 50%) serta efek sinergisme yang dinyatakan dengan CI

(Combination indeks).

Skema Tahapan Penelitian

1 A B C D E T T T T T

2 T T T T T

Uji Sitotoksik dengan MTT assay

3 4 5 6 7 8 9 10 11 T T T T T K K K K K K K K K K K K K K K JM JM JM JM JM JM JM JM JM JM JM JM JM JM JM TKJ TKJ TKJ TKJ TKJ TKJ TKJ TKJ TKJ TKJ

12

TKJ TKJ TKJ TKJ TKJ

F
G H

T
5-FU 5-FU

T
5-FU 5-FU

T
5-FU 5-FU

K
5-FU 5-FU

K
5-FU 5-FU

K
5-FU 5-FU

JM
5-FU 5-FU

JM
5-FU 5-FU

JM
5-FU 5-FU

TKJ
M KS

TKJ
M KS

TKJ
M KS

Gambar 3.2. Skema pengisian mikrokultur untuk uji sitotoksik

Keterangan : T = Ekstrak temulawak K = Ekstrak kunyit JM = Ekstrak jahe merah TKJ = Kombinasi ekstrak temulawak, kunyit dan jahe merah 5-FU = 5-Fluorouracil M = Medium RPMI KS = Kontrol sel (sel WiDr dan medium RPMI)

Uji Ko-Kemoterapi
Tabel 3.1. Konsentrasi kombinasi ekstrak tekuja dan 5-Fluorouracil yang digunakan dalam penelitian

5-Fluorouracil (IC50)

Tekuja (IC50) 1/8 1/4 3/8 1/2

1/8
1/4

1/8:1/8
1/4:1/8

1/8:1/4
1/4:1/4

1/8:3/8
1/4:3/8

1/8:1/2
1/4:1/2

3/8
1/2

3/8:1/8
1/2:1/8

3/8:1/4
1/2:1/4

3/8:3/8
1/2:3/8

3/8:1/2
1/2:1/2

Analisis Data
Analisis data persentasi penghambatan sel dihitung dengan rumus:

Analisis data IC50 yang diperoleh dilakukan uji Kolmogorov-Smirnov dilanjutkan dengan uji One Way Anova untuk mengetahui adanya perbedaaan efek sitotoksik antar kelompok uji Least Significant Diffrence (LSD) untuk membandingkan perbedaan efek sitotoksik antar kelompok.

D (D1 Dan D2) adalah konsentrasi senyawa uji yang digunakan untuk uji kombinasi dan Dx (Dx1 dan Dx2) adalah konsentrasi senyawa tunggal yang diperoleh dari intrapolasi persen viabilitas sel yang menghambat x persen pertumbuhan sel dalam perlakuan

Analisis Data
Menurut Reynolds and Maurer (2005) berbagai tingkat sinergisme atau antagonisme diinterpretasikan menggunakan nilai CI pada tabel 3.2. berikut : Tabel 3.2. Interpretasi nilai indeks kombinasi
Nilai CI < 0,1 0,1-0,3 0,3-0,7 0,7-0,9 0,9-1,1 1,1-1,45 1,45-3,3 >3,3 Interpretasi Efek sinergis sangat kuat Efek sinergis kuat Efek sinergis Efek sinergis ringan-sedang Mendekati efek aditif Efek antagonis ringan-sedang Efek antagonis Efek antagonis kuat-sangat kuat