Identificao Laboratorial de Leveduras de Importncia Mdica

Inneke Marie van der Heijden Laboratrio de Bacteriologia (LIM-54) Instituto de Medicina Tropical II Hospital das Clnicas - FMUSP

Caractersticas gerais
Grupo heterogneo
Unicelulares Diversidade

Cor das colnias

Textura

Reproduo

Reproduo das leveduras

Assexuada

Estado anamorfo

Por brotamento ou gemulao

Formao

blastocondios e pseudo-hifas

Reproduo das leveduras

Reproduo sexuada: conjugao Ascosporadas Candida guilliermondii (anamorfo) Pichia guilliermondii (teleomorfo) Anascosporadas Candida famata (anamorfo) Debaryomyces hansenii (teleomorfo) Balistosporadas Rhodotorula rubra Basidiosporadas Cryptococcus neoformans (anamorfo) Filobasidiella neoformans (teleomorfo)

Procedimentos laboratoriais
Diagnstico laboratorial Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ? Cultura: isolamento e identificao
Condies adequadas de incubao Meio de cultivo Temperatura Tempo

Meios mais utilizados na micologia

Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos

filamentosos)
Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos) Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos patognicos (uso restrito=inibe vrios fungos sensveis cicloheximida, inclusive leveduras)

Exame direto da amostra

a fresco entre lmina e lamnula
aps clarificao com KOH (10 a 20%) com tinta da China (nanquim)

aps colorao:
.esfregaos (Gram, Giemsa e outras) .cortes histolgicos (Mucicarmin de Mayer, Gomori-Grocott, H.E. e outras)

Exame da cultura: achados microscpicos

Leveduras com filamentao (hifas)

abundante: Candida spp. escassa: Candida spp e outras dezenas de gneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp)

Leveduras sem filamentao

Sem cpsula: Candida spp e outros gneros

capsuladas: Cryptococcus neoformans

Identificao Laboratorial

Exame direto - Leveduras

Colorao de GRAM

Colorao de Mucicarmin

Fonte: Laboratrio de Micologia IMT LIM HC/FMUSP

Colorao de Gomori-Grocott

Fonte: Laboratrio de Micologia IMT LIM HC/FMUSP

Identificao Laboratorial
Pureza das colnias Deteco por exame direto Sub-cultivo Tcnica de esgotamento Meios seletivos Cloranfenicol: inibir bactrias Cicloheximida: inibir fungos anemfilos

Identificao Laboratorial
Caractersticas macroscpicas

Identificao Laboratorial
Caractersticas microscpicas

Tcnica de esgotamento

Finalidade: obter colnias isoladas

Pureza das colnias

Alternativa: meios cromognicos
CHROMagar Candida Sugere espcie conforme cor da colnia: Verde = C. albicans Azul = C. tropicalis Rosa = C. krusei Branco = outras espcies e outros gneros

Identificao Laboratorial
Mtodos clssicos

Anlise morfolgica

Assimilao de fontes de carbono e nitrognio

Fermentao de carboidratos

Hidrlise da uria (teste da urease)

Mtodos comerciais

Mtodos clssicos de identificao de leveduras

Anlise morfolgica

presena de cpsula

produo de tubo germinativo, em geral leitura s 2h

cultivo em lmina (micromorfologia, filamentao e presena de clamidosporos)

Tubo germinativo
Identificao presuntiva e rpida de Candida albicans Descrito em 1960 Capacidade de formar filamentos na presena de soro (1-3 h)

Humano, fetal bovino ou cavalo

Tcnica simples 94-97% de positividade para C. albicans Sidrim et al., 1999

Fonte: Manual da ANVISA, 2005-Mdulo 7

Anlise morfolgica
Produo de tubo germinativo
1 2

1 - ausncia de tubo germinativo 2 - presena de tubo germinativo

Produo de tubo germinativo

Anlise morfolgica
Cultivo em lmina

Fonte: Manual da Anvisa, 2005- Mdulo 7

Cultivo em lmina
Espcies de Candida spp

Candida albicans

Anlise morfolgica
Presena de cpsula

Anlise morfolgica
Presena de cpsula

Mtodos clssicos de identificao de leveduras

Assimilao de fontes de C Assimilao de nitrognio

Fermentao de carboidratos

AUXANOGRAMA

ZIMOGRAMA

Hidrlise da uria (teste da urease)

AUXANOGRAMA
Presena de oxignio Utilizao de fontes de:

Carbono (a partir de acares) Nitrognio (a partir de nitrato)

CQ: cepas ATCC

AUXANOGRAMA

Meio basal sem fonte de carbono

Slido ou lquido Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL

Inculo: escala 1 McFarland (2mL) Incorporar suspenso de levedura ao meio

Aplicao de discos ou acar in natura

Incubao 30oC por 24-48h

AUXANOGRAMA
Meio basal sem fonte de nitrognio

Slido Yeast Carbon Base (YCB)- 20mL

Inculo: escala 1 McFarland (1mL) Incorporar suspenso de levedura ao meio

Auxanograma
Aplicao de compostos nitrogenados

Peptona (controle positivo) Nitrato de potssio

Incubao 30oC por 24-48 h at 7 dias

Resultados: presena de zona de crescimento (leitura visual)

ZIMOGRAMA

Baixa tenso de oxignio

Fermentao Utilizao de fontes de Carbono

a partir de acares produo de CO2

Meio lquido ou semi-slido gelosado

a 0,6%

ZIMOGRAMA

Meio basal (3mL)

Azul de bromotimol (opcional), extrato de levedura, peptona, etanol 95% e gua

Soluo de acar 6% (1,5mL)

Suspenso levedura: 2 McFarland (0,2mL/tubo)

Leitura aps 10-14 dias de incubao a 37oC Resultados: presena ou ausncia de bolhas no tubo de Durham

Testes adicionais
Teste da urease

Positiva: Cryptococcus neoformans Negativa: Candida albicans

Resistncia cicloheximida

Resistentes: C. albicans, C. stellatoidea,

C.guilliermondii e C.pseudotropicalis

Cultura positiva

Fluxograma para Identificao de Leveduras de Importncia Mdica

Exame direto
Bactria Levedura

Cultura Pura

Sim

No

Obter Colnia Pura por isolamento

Cpsula +
Macromorfologia

Tubo Germinativo

Colnia bege: Criptococcus sp Colnia salmo/laranja: Rhodothorula sp

+
C. albicans

Provas Bioqumicas e Cultivo em Lmina (continua)

Cultivo em lmina

Provas bioqumicas
Blastocondios - Urease positiva:

Inositol - : Rhodotorula

Inositol + : Cryptococcus

Presena de artrsporos(=artroconidios)

Urease - : Geotrichum
Urease + : Trichosporon (brotamento +)

Artrsporos

Geotrichum sp.

www.botany.utoronto.ca

www.mycology.adelaide.edu.au

Artrsporos Trichosporon sp.

http://www.doctorfungus.org

Trichosporon beigelii

Sidrim et al., 1999

Mtodos comerciais de identificao de leveduras

Chromoagar Candida API 20C AUX (BioMrieux) ID 32C (BioMrieux) Candifast (International Microbio) Vitek (BioMrieux)

Meios cromognicos
Cromognicos: detectam enzimas atravs de substratos especficos ou substratos cromgenos Permitem deteco de colnias mistas

Rpida identificao de C. albicans

Chromoagar Candida

Colnias:
Verdes = C. albicans Azul = C. tropicalis Rosa = C. krusei Branco = outras espcies

Painel de identificao
API20C AUX system (BioMrieux)
19 testes assimilativos - incubao 30oC - 24, 48 e 72 horas Leitura por verificao de crescimento - turbidez Necessidade de correlao com a anlise morfolgica Informa a necessidade de testes adicionais Mtodo de referncia Acurcia entre 96 e 98% para as espcies patognicas mais comuns, sem testes adicionais

API20C AUX system (BioMrieux)

API20C AUX system

(BioMrieux)

API20C AUX system (BioMrieux)

ID 32 C STRIPS (BioMrieux)
29 testes leitura aps 24/48 horas de incubao a 30oC visual ou automatizada taxas de identificao variam de 94 a 98 % Ramani et al, 1998

taxa de identificao de 92% para as espcies comuns de leveduras 85 % para isolados raros

apresenta uma base de dados bastante ampliada

Comparao entre os mtodos comerciais semi-automatizados mais utilizados na identificao de leveduras

Fonte: Sidrim e Moreira, 1999.

Candifast (International Microbio)

Identificao e teste de sensibilidade Gneros: Candida, Trichosporon, Cryptococcus, Rhodotorula e Saccharomyces nico inculo e leitura colorimtrica Resultados em 24 a 72 horas (37oC) Identificao sensibilidade actidione fermentao de 7 acares hidrlise da uria Teste de Sensibilidade sete antifngicos: 1 concentrao
www.int-microbio.com

Vitek system (BioMrieux)

Sistema automatizado: leitura turbidimtrica 26 substratos baseado nos mtodos convencionais Bionmero - banco de dados do sistema Resultado: percentual de probabilidade de ser a espcie identificada

Vitek system (BioMrieux)

16 espcies de Candida 6 espcies de Cryptococcus 3 espcies de Rhodotorula 2 espcies de Trichosporon 3 espcies de Geotrichum 2 espcies de Prototheca, Pichia anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia lipolytyca

Vitek system (BioMrieux)

Percentual de probabilidade baixo = testes adicionais 93 % das leveduras comuns foram identificadas 55 % das leveduras menos comum foram corretamente identificadas Falhas na identificao: 42% de C. krusei 80 % de C. lambica 88 % de T. beigelli 83 % de Cryptococcus (no C.neoformans)

Vitek system (BioMrieux)

Sistema rpido e adequado para identificar os isolados clnicos comuns Falhas na identificao de leveduras no usuais (Dooley et al, 1994)

Vitek 2
Vitek 2 ID YST Card 47 testes (29 clssicos e 18 enzimticos) leitura fluorescente automatizada 15 horas de incubao base de dados com 51 espcies inclui Candida dubliniensis e a atualizao sistemtica dos gneros Rhodotorula e Trichosporon taxa de identificao de 96,8%

Comparao entre mtodos comerciais para identificao de leveduras

Candifast X Vitek

98% de concordncia (www.int-microbio.com)

Candifast X API 20C AUX (Gundes et al., 2001)

116 isolados clnicos (C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata e

outras leveduras)

87% de identificaes corretas para API 20C 82,7% de identificaes corretas para Candifast

Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

Sidrim, JJC & Rocha, MFG (1999).

Consideraes finais
Diversos mtodos Diferentes nveis de sensibilidade, especificidade e acurcia em cada sistema Necessidade de estudo morfolgico e/ou a complementao com testes tradicionais

Escolha do(s) mtodo(s)

Realidade de cada laboratrio Freqncia de isolamento

Custo do teste
Eficcia do teste