UNIVERSIDAD SAN PEDRO ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUMICA

Alumna: Abilene Olaechea Altuna Profesora: Aurora Pea Uribe Tema: Anlisis de protenas Anlisis de vitaminas

A lo largo de este tema vamos a estudiar las distintas tcnicas que nos permiten analizar desde un punto de vista cuali y cuantitativo, el contenido proteico y vitamnico de las muestras biolgicas haciendo especial hincapi en el estudio de las protenas plasmticas. Si nos centramos en las protenas plasmticas, podemos diferenciar: Protenas plasma-especficas: componentes habituales del plasma. Protenas no plasma-especficas: aquellas que aparecen en el plasma por rotura de otras clulas. Las protenas plasma-especficas (albmina + globulinas) se sintetizan fundamentalmente en el hgado, pero tambin en: clulas plasmticas, ganglios linfticos, bazo y mdula sea.

Las protenas estn presentes en todas las clulas y en los distintos lquidos corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), lquido cefalorraqudeo (15-45 mg/dL).
En caso de enfermedad, tanto la concentracin total como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas. As, la determinacin de las protenas totales sirve para el diagnstico de: Afecciones hepticas Afecciones de la mdula sea Otras afecciones del metabolismo o nutricionales

Las protenas son molculas formadas por cadenas lineales de aminocidos. El trmino protena proviene de la palabra francesa protine, que significa 'prominente, de primera calidad'. Por sus propiedades fsico-qumicas, las protenas se pueden clasificar en protenas simples (holoproteidos), que por hidrolisis dan solo aminocidos; protenas conjugadas (heteropoteidos), que por hidrlisis dan aminocidos acompaados de sustancias diversas, y protenas derivadas. Las protenas son necesarias para la vida, sobre todo por su funcin plstica (constituyen el 80% del protoplasma deshidratado de toda clula), pero tambin por sus funciones biorreguladoras (forman parte de las enzimas) y de defensa (los anticuerpos son protenas. Las protenas desempean un papel fundamental para la vida y son las biomolculas ms verstiles y diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo y realizan una enorme cantidad de funciones diferentes.

 El organismo necesita como mnimo 20 aminocidos para la reconstruccin de nuevos tejidos. La estructura bsica de la protenas son los aminocidos. El organismo fabrica casi todos los aminocidos, excepto 8 que son los aminocidos esenciales: 1. Licina 2. Leucina 3. Triptofano 4. Fenilalanina 5. Tronina 6. Valina 7. Isoleucina 8. metionina

 Una protena se califica como buena o mala segn la cantidad de aminocidos que contenga ( + aminocidos = buena) (- aminocidos = no tan buena) La protenas deben proporcionar el 10 % a 15% de la energa que necesita el organismo.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Lactante -> 1,6 2,2 gr / kg de peso/ da Nio -> 1 12 gr / kg de peso/ da Adolescente masculino -> 0,9 1gr / kg de peso/ da Adolescente femenino -> 0,8 1gr / kg de peso/ da Adulto -> 0,8 / kg de peso/ da Deportista -> 3gr / kg de peso/ da Gestacin (2da mitad) -> +6gr/ kg de peso/ da Lactancia (1 - 6 meses) -> +15 gr / kg de peso/ da Lactancia (inferior de 6 meses) -> +12 gr / kg de peso/ da

 Soya -> 37 % Bacalao -> 30% Leche -> 35% Jamn -> 30% Mani -> 37% Atn -> 24% Guisantes -> 23% Carne de buey ->21% Sardinas -> 22% Chorizo -> 22%

 Queratina -> uas, pelo , piel Colgeno -> cartlago, hueso, tendones Elastina -> ligamentos Insulina -> pncreas Inmunoglobulinas -> anticuerpos Fibringeno -> sangre

 Mtodo del Biuret :

En solucin alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptdico de las protenas dando un color purpreo que se cuantifica espectrofotomtricamente (540nm). Como estndar se utiliza una solucin de albmina.
Protena + Cu+2 Complejo Cu-Protena (prpura) Muestra: suero o plasma. Separar el suero del cogulo o el plasma de las clulas antes de 3h. Si el paciente est acostado durante la extraccin el resultado ser menor.

 La proporcin de las fracciones proteicas individuales cambia en el transcurso de un gran nmero de enfermedades lo que conlleva que, la cuantificacin de las mismas sea de valor considerable en el diagnstico clnico. Los procedimientos ms utilizados actualmente en el laboratorio clnico para el estudio de las protenas son los siguientes: 1. Turbidimetra y nefelometra: Cuando un haz de luz choca con una partcula en suspensin parte de la luz se dispersa, parte de la luz se refleja y parte de la luz se absorbe. La dispersin de la luz depende de: la longitud de onda de la luz , del tamao de la partcula y del ndice de refraccin de la partcula en relacin con el medio que la rodea. La dispersin de la luz se puede medir por turbidimetra o por nefelometra. En ambas tcnicas, para dar como resultado una concentracin de protena concreta, se compara la cantidad de luz dispersada o la tasa de aumento de dispersin con los valores de dichos parmetros en estndares proteicos conocidos.

Mide la disminucin de la luz transmitida a travs de una suspensin de partculas utilizando para ello un espectrofotmetro (detector en la misma direccin del haz de luz, se mide A o T). Se suele utilizar para soluciones concentradas (para que haya una buena disminucin de la luz transmitida) ej. determinacin de protenas totales en suero, LCR u orina (haciendo que las protenas precipiten con cido sulfosaliclico).

Mide la luz dispersada en direccin distinta a la luz emitida. Utiliza como instrumento el nefelmetro (en el que el detector se ubica con un ngulo que oscila entre 15 y 90 ej. a 90). Se suele utilizar para concentraciones ms diluidas.

 Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partculas que

produzcan una dispersin de luz no deseada ej. lipoprotenas. Tambin puede interferir la suciedad. La intensidad de la luz dispersada aumenta al disminuir la proteina. Las protenas suelen tener un pico de absorcin en el ultravioleta (? < 300nm) y los cromgenos del suero entre 400-425nm; por todo ello se suele trabajar a cantidades que oscilen entre 320-380nm y 500-600nm. Muy frecuentemente, para cuantificar protenas concretas, se utilizan anticuerpos que reaccionan con dichas protenas de la muestra, en este caso se habla de inmunoturbidimetra e inmunonefelometra. Para enteder estas tcnicas necesitamos tener claro unos conceptos previos:

 Antgenos (Ag): sustancias, generalmente de gran tamao, capaces de estimular el sistema inmunolgico de un animal y originar una respuesta dirigida especficamente contra l. Eptopo o determinante antignico: lugar del antgeno que reconoce y se une al anticuerpo. Anticuerpo (Ac): grupo de protenas llamadas inmunoglobulinas, producidas por linfocitos B y su progenie (clulas plasmticas) que se combinan especficamente con los antgenos. Cuando se ponen en contacto un Ag y un Ac especfico contra ese antgeno ambos reaccionan y forman un complejo Ag-Ac. Inicialmente los complejos se forman rpidamente pero, existe una segunda fase de crecimiento de complejos ms lenta y, es precisamente en sta fase en la que aparece la dispersin de la luz. As, en la inmunoturbidimetra e inmunonefelometra se mide la dispersin de la luz provocada por los compeljos Ag-Ac. En ocasiones los Ac se unen a bolitas de ltex para aumentar el tamao de los complejos (inmunoanlisis potenciados).

2. Inmunodifusin : La inmunodifusin se basa en la formacin de bandas de precipitacin Ag-Ac en medios semislidos . La formacin de inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH, temperatura, fuerza inica del medio, caractersticas propias del Ac como afinidad y avidez y, la ms importante, la concentracin relativa de Ag y Ac. La zona ptima de concentracin para la formacin del precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia. La inmunodifusin puede ser simple (slo se mueve el Ag o el Ac) o doble (se mueven Ag y Ac). Para visualizar el resultado de la inmunodifusin, una vez terminada la difusin se lava el gel y se tie con colorantes para protenas (ej. negro amido o azul brillante de Coomassie). La inmunodifusin se puede clasificar atendiendo a distintos criterios. Entre otras modalidades podemos hablar de:

 En este caso se aade un antisuero especfico a la agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en ellos estndares de protenas y problemas (antgenos). El antgeno difunde en el gel durante varias horas y va reaccionando con el Ac. En la zona de equivalencia se produce un anillo de precipitacin

Se forman pozos en el gel de agarosa, generalmente en patrn de roseta. Se depositan antisueros especficos en los pozos centrales y los estndares de protenas y los problemas en los pozos circundantes. Al difundir las muestras en el gel, donde el anticuerpo y el antgeno alcanzan la equivalencia, se forman bandas de precipitados insolubles. La posicin y forma de la banda se determinan segn la concentracin del antgeno y del anticuerpo, y sus tamaos. La distancia de las bandas con respecto al anticuerpo es directamente proporcional a la cantidad de antgeno presente.

1. Es necesario que las concentraciones de Ag y Ac sean similares o de lo contrario no se alcanza la equivalencia y no se forma el precipitado. El precipitado solo se forma en el punto de equivalencia o cuando hay un ligero exceso de Ag. 2. Las molculas ms pequeas migran con ms rapidez que las de gran tamao y conforme la migracin contina el precipitado puede redisolverse y volverse a formar de acuerdo con los cambios de concentracin de Ag o Ac en el gel. 3. Si hay grandes cantidades de Ac, el antgeno no se difunde muy lejos antes de alcanzar la equivalencia y el anillo es ms grueso o espeso.

 3. Electroforesis:

Una de las tcnicas ms sencillas para la separacin (y posterior cuantificacin) de protenas es la electroforesis (tcnica en la cual una partcula cargada se hace desplazar a travs de un medio aplicando un campo elctrico). Cuando se aplica un campo elctrico a un medio que contiene partculas cargadas, las partculas cargadas negativamente migran hacia el nodo o polo positivo mientras que, las cargadas positivamente migran hacia el electrodo negativo (ctodo). Este principio se puede aplicar para separar las fracciones de protenas puesto que los aminocidos (aa) constituyentes de la protenas, y por tanto las protenas, son compuestos anfteros que se comportan como cidos.

 4. Inmunoelectroforesis: La inmunoelectroforesis es una inmunodifusin en la que se aplica una corriente elctrica para separar las protenas de la muestra. Esta tcnica se realiza en dos fases: Electroforesis para separar las protenas de la muestra en funcin de su carga. Aplicacin de un antisuero, mono o poliespecfico, en un surco paralelo a la direccin del campo elctrico. El o los anticuerpos se difunden durante 18-24h. Si se produce el reconocimiento Ag-Ac se forman bandas de precipitacin.

5. Inmunoelectroforesis en cohete: La inmunoelectroforesis en cohete es una tcnica cuantitativa equivalente a la inmunodifusin radial pero, a en la que la placa se expone a un campo elctrico. Al igual que en la inmunodifusin radial, el antisuero (Ac) se incorpora al gel de manera que el Ac no pueda migrar. En el gel se realizan unos pocillos (generalmente en el ctodo) que se rellenarn con la muestra o con diluciones patrn. Una vez depositadas stas se activa el campo elctrico. El Ag se desplaza en la agarosa y precipita al encontrarse con el Ac. La precipitacin va producindose a medida que el Ag avanza hacia el nodo de manera que al ir disminuyendo la concentracin de Ag los bordes laterales se van acercando hasta unirse.

As, se produce una precipitacin triangular (en estela de cohete). La concentracin de Ag de la muestra es directamente proporcional al rea y altura del tringulo. Comparando los resultados de la muestra con los obtenidos en las diluciones patrn obtendremos un resultado cuantitativo.

 6. Inmunofijacin:
La inmunofijacin consiste en la separacin electrofortica de las protenas de una muestra seguida del contacto del gel con una tira de acetato de celulosa impregnada con antisuero. La unin Ag-Ac da lugar a la formacin de bandas de precipitacin visulalizadas tras lavar y teir. Es una tcnica muy rpida que se utiliza especialmente en le deteccin de bandas oligoclonales en lquido cefalorraqudeo.

La agarosa es un polisacrido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de las algas de los gneros gellidium y gracillaria. Es soluble en agua a temperaturas superiores a los 65 C, dependiendo del grado de sustituciones hidroxietlicas de sus cadenas laterales. Sustituciones las cuales, se pueden modificar para provocar que la temperatura de gelificacin vare entre los 17 y los 40 C. La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no txica que supone una herramienta indispensable en gran cantidad de tcnicas de biologa molecular, bioqumica y biologa celular. Su uso ms extendido es para construir geles que permitan separar molculas de ADN mediante electroforesis, adems de ser utilizada para fijar molculas a su estructura como anticuerpo, antgeno y enzimas. Igualmente se utiliza para el cultivo celular y microbiologa. Otros usos menos extendidos son la utilizacin de estos geles como matrices en la reparacin de tejidos daados.

Los requisitos mnimos diarios de las vitaminas no son muy altos, se necesitan tan solo dosis de miligramos o microgramos contenidas en grandes cantidades (proporcionalmente hablando) de alimentos naturales. Tanto la deficiencia como el exceso de los niveles vitamnicos corporales pueden producir enfermedades que van desde leves a graves e incluso muy graves como la pelagra entre otras, e incluso la muerte. Algunas pueden servir como ayuda a las enzimas que actan como cofactor, como es el caso de las vitaminas hidrosolubles La deficiencia de vitaminas se denomina avitaminosis mientras que el nivel excesivo de vitaminas se denomina hipervitaminosis. Est demostrado que las vitaminas del grupo B son imprescindibles para el correcto funcionamiento del cerebro y el metabolismo corporal. Este grupo es hidrosoluble (solubles en agua) debido a esto son eliminadas principalmente por la orina, lo cual hace que sea necesaria la ingesta diaria y constante de todas las vitaminas del complejo "B" (contenidas en los alimentos naturales).

Mtodos microbiolgicos:
Se basan en cultivos de cepas de microorganismos cuyo desarrollo depende especficamente de una determinada vitamina. Se usan bsicamente en vitaminas hidrosolubles. El medio de cultivo donde realizamos, la siembra carece de la vitamina en cuestin y sta es aportada por extractos del alimento donde queremos evaluar la vitamina. Paralelamente se hace un control donde sembramos el microorganismo sin vitaminas y tambin se siembra el microorganismo en diversos medios con contenido vitamnico diverso. Se compara el crecimiento.

Mtodos Biolgicos:
Se observan los efectos curativos o fisiolgicos de las vitaminas sobre animales de experimentacin. Son los que menos se utilizan porque la experimentacin animal es muy variable, adems son ensayos muy largos e influye el factor tico. Adems, los microbiolgicos son mejores.

Mtodos Fisico Qumico.

Van bien para la mayora de las vitaminas, aunque en la mayor parte de ellos nos encontramos en 3 problemas fundamentales: Son ms inestables. Las vitaminas se pueden destruir por calor, cidos, bases, luz. Por esto, durante todo el proceso (toma de muestras, almacenamiento, procesado y anlisis) deben evitarse los factores que provoquen la destruccin de la vitamina. Baja concentracin de las vitaminas en los alimentos. Existencia de diversos vitmeros, que son sustancias con actividad vitamnica y composicin diferente. Desde el punto de vista analtico hay dos tipos de vitaminas: las liposolubles o solubles en disolventes orgnicos y las hidrosolubles o solubles en agua. Esta clasificacin es til porque da idea de los procesos extractivos que hay que realizar. Normalmente , las vitaminas se analizan por tcnicas de HPLC

ANLISIS DE VITAMINAS LIPOSOLUBLES

Las vitaminas liposolubles A, D, E y K son factores esenciales en el metabolismo humano. Por razones nutricionales y econmicas es importante tener un mtodo analtico sensible y robusto. Tradicionalmente se han utilizado mtodos para la cuantificacin de vitaminas liposolubles que utilizan cromatografa de lquidos por fase normal utilizando solventes costosos y txicos. Otras tcnicas como la cromatografa de gases o por fase reversa, muestran baja sensibilidad o un tiempo de anlisis prolongado que puede superar los 60 minutos.

Cromatografa de lquidos HPLC

Principios de la tcnica En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.

HPLC preparativa

Es la tcnica escogida para aislamiento y purificacin de productos de valor en las industrias qumicas y farmacuticas as como en la biotecnologa y la bioqumica. La cromatografa preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1g de muestra para identificacin espectroscpica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.

Aplicaciones
Campos de Aplicacin de HPLC

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.

Funcionamiento del servicio Las muestras deben ir acompaadas de la hoja de solicitud de servicios generada en esta pgina web una vez realizado el registro en la misma. El ususario debe rellenar todos los campos de la solicitud de servicios que conozca, con el fin de obtener el mejor resultado posible. Cuatro componentes La tcnica HPLC contiene cuatro componentes principales. En primer lugar, es importante el sistema de entrega de disolvente (fase mvil) que lleva las muestras a travs de la columna, ya que la polaridad afecta la capacidad que tiene el sistema para separar las molculas. La columna de cromatografa es generalmente una columna de vidrio vertical que se llena con un adsorbente. En segundo lugar, el adsorbente (tambin conocido como fase estacionaria, ya que no se mueve) es comnmente un gel de slice o almina. En tercer lugar, el sistema de introduccin de la muestra se compone de una especie de puerto de inyeccin para introducir la muestra que se va analizar en el sistema de entrega del disolvente. El cuarto componente es el detector.

Detectores El tipo de detector a utilizar depende del tipo de muestra que los tcnicos estn analizando y lo que las molculas estn tratando de aislar. Entre los criterios utilizados por el tcnico a la hora de elegir un detector se encuentra la selectividad, la relacin seal-ruido, lmite de deteccin, rango lineal, constante de tiempo, arrastre y volumen celular. Entre los detectores ms utilizados se encuentran los detectores visibles ultravioletas, espectrmetros de masas, ndices de refraccin, detectores fluorescentes o dispositivos de dispersin de luz evaporada.

Procedimiento Gira el detector, las bombas (que se utilizan para aumentar la presin para mover la fase mvil a travs de la fase estacionaria), y la computadora que grabar e imprimir el cromatograma. Elije los programas adecuados para recolectar los datos deseados. Inyecta la muestra en el puerto de inyeccin. Vigila la presin. Cada tipo de columna posee una presin mxima; no excedas este valor o no ocurrir la separacin. Imprime el cromatograma y analiza los resultados. Al final de cada procedimiento, es importante limpiar el puerto de inyeccin para evitar la acumulacin que pueda bloquearlo.

Tipos La cromatografa de interaccin hidrfila utiliza una fase unida estacionaria polar y una no polar, una fase mvil miscible de agua para separar molculas basadas en polaridad. Esta tcnica tiene la capacidad de separar muestras cidas, bsicas y neutras en un cromatograma clave. La cromatografa de fase normal utiliza una fase estacionaria polar y una fase no polar, una fase mvil no acuosa para separar ismeros estructurales (molculas con la misma frmula molecular que tienen los tomos unidos entre s de distintas maneras). La cromatografa en fase reversa es la ms ampliamente utilizada. Utiliza una fase estacionariano polar y una acuosa como una fase mvil polar. Este mtodo es utilizado comnmente por las compaas farmacuticas para calificar las drogas antes de su comercializacin. La cromatografa de exclusin por tamao separa las molculas en funcin a su tamao y tambin puede determinar la estructura de las protenas. La cromatografa de intercambio inico se basa en la atraccin entre los iones del soluto y los sitios cargados unidos en la faseestacionaria.