ANALISIS GENETICO EN LEVADURAS

Son eucariotas, y por lo tanto ms semejantes. A diferencia de las bacterias, producen cierto tipo de modificaciones postraduccionales en las protenas (glucosilaciones en ciertos aminocidos, eliminacin de la metionina inicial, rotura proteoltica de un precursor inactivo, etc.), lo que puede hacer que las protenas heterlogas de organismos superiores puedan alcanzar su actividad biolgica (aunque esto no siempre est garantizado) A semejanza de ciertas bacterias, la levadura Saccharomyces cerevisiae es muy fcil de manejar con mtodos microbiolgicos S. cerevisiae est muy bien estudiada al nivel gentico y molecular.

Vectores de levaduras
Vectores integrativos (YIp): suelen contener un gen silvestre de levadura, lo que permite que el vector se inserte, por recombinacin homloga, con secuencias homlogas de la levadura husped. No se suelen emplear para la expresin de genes heterlogos. Vectores de replicacin autnoma basada en componentes cromosmicos.
(YRp)Vectores con secuencias de replicacin autnoma (ARS): suelen ser vectores inestables, por lo que no tienen inters industrialVectores YCp con ARS y secuencias centromricas (CEN): al disponer de secuencias de centrmeros de levadura, se segregan mejor a las clulas hijas, por lo que son ms estables, aunque se siguen perdiendo poco a poco, por lo que tampoco son demasiado tiles para la expresin a escala industria.

 Cromosomas artificiales de levadura (YAC): son vectores que cuentan con una secuencia ARS, una secuencia CEN y dos secuencias telomricas (TEL). Estn previstos para insertar grandes trozos de ADN (de ms de 100 kb). No se usan como vectores de expresin, sino como vectores de gran capacidad a la hora de generar genotecas de organismos complejos y preparar la secuenciacin (por ejemplo, los llamados megaYACs han sido muy tiles en el Proyecto Genoma Humano). Vectores basados en el crculo de 2mm de levadura: se trata de vectores que se aprovechan de un plsmido natural de S. cerevisiae, conocido simplemente como crculo de 2mm (por su tamao). Es un plsmido crptico (no codifica funciones fenotpicas aparte de su propia replicacin) existente en algunas cepas (cepas cir+) que se encuentra en unas 50 a 100 copias en el ncleo, constituyendo una especie de minicromosoma estable. Los vectores incorporan algunas de las secuencias del 2mm implicadas en su replicacin y mantenimiento.

Saccharomyces cerevisiae
1.2x107 pares de bases, 200 mas pequeo que el humano. Tiempo de reproduccin de 2 horas. Mutaciones fcilmente identificables. Fcil de aislar levaduras mutantes.

Mutantes con sensibilidad trmica o termoestables

Codifican protenas que son funcionales a determinada temperatura (tem. Permisiva) pero no a otra (no permisiva). Normales: a las 2 temperaturas. Aislar mutantes por crecer solo en temperatura permisivas. Identificacin de genes de la levadura: procesos celulares.

Clonacin de genes de levaduras

Se escoge el vector de clonacin. Inicio de replicacin de levaduras y un gen marcador (Leu2) facilita la deteccin de la levadura transformada (crece en medio carente de leucina). Gen de inters: mutacin sensible a la temperatura. Se escogen las cepas que forman colonias en temperatura no permisima (37grados)

 Se han identificado genes de levadura que codifican una amplia variedad de protenas esenciales. Identificar y clonar genes relacionados con clulas de mamferos.

Transferencia de genes en plantas y animales

La metodologa para la introduccin del ADN en clulas animale fue desarrollado inicialmente para ADN vricos infecciosos (transfeccin).

Mtodos de introduccin de ADN

Microinyeccin directa en el ncleo celular. Coprecipitacin de ADN con fosfato clcico para formar peque;as partculas que sern internalizadas por las clulas. Incorporacin del ADN en vesculas lipdiacas (liposomas) que se fucionan con las membrana plasmtica. Exposicin de la clulas a un breve pulso elctrico, abre poros de la membrana (electroporacin)

Microinyenccin

En la primera fase, se aislan un nmero grande de vulos fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un tratamiento hormonal para provocar una superovulacin. La fertilizacin puede hacerse in vitro o in vivo. En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una micropipeta a modo de aguja, se introduce una solucin que contiene ADN. En la tercera fase, estos vulos son reimplantados en hembras que actuarn como nodrizas permitiendo la gestacin hasta trmino. Por ltimo, tras el destete de los recin nacidos, stos se chequean, para ver si ha ocurrido la incorporacin del transgn.

Coprecipitacin del ADN

Los coprecipitados de fosfato de calcio y de ADN purificado se han empleado por mas de 20 aos para la transferencia y expresin de informacin gentica en clulas de mamferos en cultivo. Descrita por vez primera para introducir ADN de adenovirus en clulas de mamferos. Forma peque;as partculas que sern internalizadas por las clulas.

Liposomas
El uso de complejos de DNA-liposomas formados por DNA (cargado negativamente) y liposomas catinicos (cargados positivamente) ha mejorado la eficiencia y reproducibilidad de la transfeccin obtenida con mtodos anteriores. El uso de liposomas catinicos tiene las ventajas de que forman complejos electrostticos con el DNA, se introducen espontneamente en las clulas facilitando el transporte del DNA al ncleo y hacen al DNA resistente a las nucleasas condensndolo en partculas mayores de 50 nm de dimetro

Electroporacin
Exposicin de las clulas a un breve pulso elctrico que abre, de forma transitoria, poros en la membrana plasmtica.

expresin
El AdN internalizado puede transcribirse durante varios das, (expresin transitoria). 1% o menos el ADN se integra de forma estable al genoma y se transfiere a las siguientes generaciones. Puede ser identificado si posee un marcador como resisteccia a una droga.

Retrovirus como vectores.

Son utilizados porque su ciclo de vida incluye una integracin estable del ADN vrico en el genoma de la clula infectada.

Introduccin en la lnea germinal

Introduccin del ADN clonado en el proncleo de un vulo fertilizado. Animales transgnicos (ratones transgnicos). vulos inyectados se introducen en madres adoptivas y se permite su desarrollo. 10% de la progenie tendrn integrado el ADN extrao en el genoma del vulo fertilizado. Y estar presente en todas las clulas del animal.

Ratones transgnicos.

En clulas vegetales
Bombardeo con microproyectiles envueltos en ADN. Algunas clulas mueren y otra sobreviven y pasan a estar transformadas de forma estable.

Plasmido de la bacteria Agrobacterium tumefaciens Ti

En la naturaleza la bacteria se une a las hojas de las plantas y el plsmido Ti se transfiere a las clulas vegetales incorporndose al ADN cromosmico. Plantas transgnicas se obtienen directamente de clulas donde se introdujo el ADN recombinante.

Mutagnesis de ADN clonados

Genes mutantes son detectados porque producen cambios fenotpicos observables. Ahora se pueden introducir mutaciones y observar el efecto. GENTICA INVERSA Expresin gnica

Mutagnesis in vitro
Introduccin de deleciones, inserciones o alteraciones de nucletidos nicos. Uso de oligonucletidos sintticos para generar cambios de nucletidos en la secuencia del DNA. Oligonucletido porta la base mutante como cebador para la snteis de DNA.

Introduccin de mutaciones en genes celulares.