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CURVAS ANALTICAS E CALIBRAO

Vagner F Knupp 15.08.2011

CALIBRAO
A calibrao, em geral, uma operao que relaciona uma grandeza de sada com uma grandeza de entrada, para um sistema de medida sob determinadas condies. Calibrao em Qumica Analtica a operao que determina a relao funcional entre valores medidos (intensidades y de sinais em certas posies z j ) e grandezas analticas caracterizando os tipos de analitos qi e suas quantidades ou concentraes x .

Formas de calibrao

- Padres externos
- Adio de padro - Padro interno

Formas de calibrao

1 - Padres externos

Formas de calibrao
1 - Padres externos
a forma mais utilizada de calibrao. So utilizadas solues contendo concentraes conhecidas do analito. Os padres so considerados externos pois so preparados e analisados separadamente das amostras. Normalmente so utilizadas solues com concentraes crescentes do padro do analito e correlacionando-se a resposta instrumental com a concentrao, se obtm uma curva de calibrao.

Formas de calibrao
A curva de calibrao pode ser linear (correlao entre resposta instrumental e concentrao apresenta funo linear) ou polinomial (correlao entre resposta instrumental e concentrao apresenta funo polinomial). A curva linear mais adequada pois apresenta a mesma sensibilidade para toda a faixa de calibrao. Nas curvas no lineares, a sensibilidade funo da concentrao.

Formas de calibrao
Curva analtica linear Curva analtica no linear

Formas de calibrao
Limitao da curva de calibrao normal A relao entre a resposta instrumental (Spadro) e a concentrao (Cpadro) determinada quando o analito est presente na matriz da soluo padro que pode ser diferente da matriz da amostra. Quando se utiliza a curva de calibrao normal, assumimos que qualquer diferena entre a matriz dos padres e a matriz da amostra no afeta a inclinao da curva (sensibilidade). Um erro proporcional determinado introduzido quando as diferenas entre as duas matrizes afetam a sensibilidade.

Formas de calibrao

Para se avaliar se as diferenas entre as inclinaes das curvas so significativas, pode se aplicar os testes estatsticos F e t.

Formas de calibrao
Quando o efeito de matriz esperado e a matriz da amostra conhecida, pode-se realizar uma curva por ajuste de matriz (matrix matching). Neste mtodo de calibrao, a matriz da amostra adicionada nos padres de calibrao de modo a se compatibilizar a matriz e minimizar os erros. Obs: nem sempre se consegue realizar o ajuste de matriz, pois muitas vezes difcil obter a matriz sem o analito.

Formas de calibrao
O desvio padro calculado para inclinao (m) e interseo (b) pelas formulas do mtodo dos mnimos quadrados:

Formas de calibrao
E o desvio padro da amostra usando a formula:

Exerccio
Um processo de tratamento para efluentes contendo Fe est sendo avaliado. A eficincia do processo de precipitao est sendo monitorada aps a adio de diferentes quantidades do agente precipitante. Desta forma, aps cada tratamento, uma alquota do sobrenadante coletada para posterior determinao de Fe por espectrometria de absoro atmica. Um volume de 2,00 mL dessas amostras foi diludo para 10,0 mL e as mesmas foram analisadas contra uma curva de calibrao aquosa. Suspeitando de uma possvel interferncia da matriz, o analista resolveu realizar uma calibrao por ajuste de matriz.

Dados obtidos
C
0
0,5

Abscn
0,050
0,090

Abscaj
0,004
0,030

1 1,5
2 3 4

0,132 0,169
0,218 0,292 0,37

0,065 0,095
0,13 0,200 0,266

Dados obtidos
0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 -0.050.00 1.00 2.00 y = 0.0664x - 0.001 R2 = 0.999 Com Ajuste y = 0.0803x + 0.051 R2 = 0.9993 Sem ajuste

Sinal (A)

3.00

4.00

5.00

Conc Fe (mg/L)

As absorbncias apresentadas abaixo foram obtidas para o branco e para as amostras (100, 75, 50 e 25 gramas de precipitante utilizados).

Amostra Branco

Absorbncia -0,009

T100
T75 T50 T25

0,040
0,093 0,192 0,245

Considerando que o limite estabelecido pelo CONAMA para Fe em efluentes 15,0 mg/L, o uso da curva aquosa poderia conduzir a alguma tomada de deciso equivocada?

Amostra
Branco T100 T75 T50 T25

A
-0.009 0.04 0.093 0.192 0.245

Conc Sem ajuste 0.52 1.13 1.79 3.03 3.69

Dil x5 x5 x5 x5 x5

mg/L 2.62 5.67 8.97 15.13 18.43

Amostra
Branco T100 T75 T50 T25

A
-0.009 0.04 0.093 0.192 0.245

Conc Com ajuste -0.12 0.62 1.42 2.91 3.70

Dil x5 x5 x5 x5 x5

mg/L -0.60 3.09 7.08 14.53 18.52

Formas de calibrao

2 - Adio de padro

Formas de calibrao
2 - Adio de padro
uma forma de calibrao muito utilizada quando se tem efeito de matriz e no possvel realizar o ajuste de matriz. Neste mtodo de calibrao, quantidades conhecidas do analito so adicionadas a bales contendo volumes fixos da amostra. Posteriormente, o volume do balo completado com um diluente adequado (gua, cidos diludos, solventes orgnicos, etc.) As respostas instrumentais so obtidas para cada uma das solues e se obtm a relao linear entre a quantidade de analito adicionada e a resposta instrumental.

Formas de calibrao
2 - Adio de padro

Exemplo do preparo de uma curva de calibrao por adies de padro

Formas de calibrao
2 - Adio de padro
Cuidados
Deve-se ter uma idia da concentrao do analito na amostra para se definir a alquota da amostra a ser tomada e as adies do padro que sero realizadas. A faixa linear da tcnica de medida deve ser respeitada, ou seja, a soma da concentrao do analito na amostra e da adio do padro no ltimo ponto deve ser menor que limite da faixa linear.

Formas de calibrao
2 - Adio de padro
Clculo
Extrapolao no grfico ou Utilizar a equao linear e calcular x quando y = 0

Formas de calibrao
2 - Adio de padro
Como a curva de calibrao por adio de padro construda na amostra, ela no pode ser estendida para a anlise de outras amostras. Desta forma, para cada amostra deve-se construir uma curva de calibrao. Este fato dificulta a aplicao deste mtodo de calibrao para anlises de rotina, onde um grande nmero de amostras precisa ser analisado. O mtodo de adies de padro pode ser utilizado para checar a validade da curva de calibrao por padres externos (avaliao do efeito de matriz).

Formas de calibrao
2 - Adio de padro
O resultado obtido da curva analtica: Y = m X + b fazendo Y = 0 X = -b/m Lembre de que a construo da curva analtica implica em diluio da amostra que deve ser compensado.

Formas de calibrao
2 - Adio de padro
O desvio padro da concentrao ser:

EXERCCIO
A determinao de Cu em cachaa deve ser feita por adio de padro, pois difcil simular a composio da matriz. Sabendo-se que a concentrao aproximada de cobre em uma amostra de cachaa 8 mg/L e que a faixa linear para Cu em espectrometria de absoro atmica com chama 0 a 3 mg/L, faa os clculos para o preparo da curva por adio de padres.

EXERCCIO Calcule a concentrao de Cobre na amostra

C
0 0.5 1

abs
0.089 0.120 0.152

0.206

C
0

abs
Sinal (A)

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -2.5 -1.5 -0.5 0.5 1.5 2.5 Conc Cu (mg/L) y = 0.0585x + 0.0906 R2 = 0.9982

0.089

0.5 1
2

0.120 0.152
0.206

y = 0.0585x + 0.0906 se y = 0 logo x = -0.0906 / 0.0585 = 1.54 mg/L

Formas de calibrao

3 - Padro Interno

Formas de calibrao
3 - Padro Interno
O sucesso da utilizao dos mtodos de calibrao com padres internos e de adies de padro depende da habilidade do analista manusear amostras e padres reprodutivelmente e da estabilidade do equipamento. Quando o procedimento no pode ser controlado de forma que todas as amostras e padres so tratados igualmente, a exatido e preciso do mtodo podem ser comprometidos.

Formas de calibrao
3 - Padro Interno
Nos casos onde o processo analtico no reprodutvel, a padronizao possvel se o sinal do analito for referenciado ao sinal gerado por outra espcie que foi adicionada em concentrao fixa e conhecida em todos os padres e amostras. A espcie adicionada chamada de padro interno e deve ser essencialmente diferente do analito.

Formas de calibrao
3 - Padro Interno
Desde que o analito e o padro interno em qualquer amostra ou padro recebem o mesmo tratamento e esto sujeitos as mesmas variaes, a razo dos sinais no ser afetada. Se uma soluo contem um analito de concentrao CA e um padro interno de concentrao CPI, ento o sinal devido ao analito, SA, e ao padro interno, SPI, so:
SA = kACA SPI = kPICPI
Sendo kA e kPI, as sensibilidades do analito e do padro interno

Formas de calibrao
3 - Padro Interno
Desta forma:

Onde K a razo da sensibilidade do analito e do padro interno.

Para se facilitar a aplicao do padro interno, plota-se a curva de calibrao relacionando-se a razo sinal do analito (SA)/sinal do padro interno (SPI) X a concentrao do analito (CA)
Para se obter a concentrao do analito na amostra, basta utilizar a razo sinal do analito na amostra/sinal do padro interno e jogar na equao da curva de calibrao.

Formas de calibrao
3 - Padro Interno
Caractersticas desejveis: Ter comportamento semelhante ao do analito de interesse, de forma a estar sujeito as mesmas interferncias e flutuaes que o analito. Ser detectado simultaneamente ao analito (tcnicas multielementares) e ter sinal distinto do sinal do analito. Idealmente no estar presente na amostra (adiciona-se uma quantidade conhecida e constante) em todas as solues (brancos, padres, amostras).

EXERCCIO

Na determinao de anfetaminas em urina por HPLC, a efedrina foi utilizada como padro interno. Os dois compostos apresentam tempos de reteno distintos. Os resultados obtidos para a curva de calibrao, branco e amostra so apresentados abaixo:
Amostra
Branco

Conc. Analito (mg/L)


0

rea
216 4529 11312 18659 43269 98562 515 63917

Conc. PI (mg/L)
1,0

rea
50289

Padro 1
Padro 2 Padro 3 Padro 4 Padro 5 Branco amostra Amostra

0,05
0,10 0,25 0,50 1,0 -

1,0
1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

48370
52360 42390 46350 53240 47235 56759

Calcule a concentrao de anfetamina na amostra.

EXERCCIO
Sem uso do padro interno

120000 100000

Sinal (rea)

80000 60000 40000 20000 0 -20000 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 y = 97206x - 1357.4 R2 = 0.9922

=((Sinal Am Sinal Br) b)/a =((63917 - 515)+1357.4) / 97206 = 0.67 mg/L

Conc Analito (mg/L)

EXERCCIO
Com uso do padro interno

Amostra

Branco Padro 1 Padro 2 Padro 3 Padro 4 Padro 5 Branco amostra Amostra

Conc. Analito (mg/L) 0 0.05 0.1 0.25 0.5 1 -

rea

Conc. PI (mg/L) 1 1 1 1 1 1 1 1

rea

Razo San/SPI 0.004 0.094 0.216 0.440 0.934 1.851 0.011 1.126

216 4529 11312 18659 43269 98562 515 63917

50289 48370 52360 42390 46350 53240 47235 56759

EXERCCIO
Com uso do padro interno

2.000 1.800 1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0 0.2 0.4

Sinal (rea)

=((Sinal Am Sinal Br) b)/a


y = 1.8438x + 0.0059 R2 = 0.9994

=((1.126-0.011)-0.0059)/1.8438 = 0.60 mg/L

0.6

0.8

1.2

Conc Analito (mg/L)

Formas de calibrao
3 - Padro Interno
O desvio padro calculado para inclinao (m) e interseo (b) pelas formulas do mtodo dos mnimos quadrados:

Formas de calibrao
3 - Padro Interno
E o desvio padro da amostra usando a formula:

Lembrando de usar as equaes obtidas com uso do padro interno

Correo do branco

Correo do branco
Existem pelo menos quatro diferentes formas que so utilizadas:

a) Ignorar completamente a correo b) Utilizar o intercepto da curva de calibrao como branco de calibrao c) Utilizar um branco analtico para correo d) Utilizar ambos (branco da calibrao e branco de reagente)

Correo do branco
Considere os seguintes dados, que foram obtidos na determinao de Pb:
Curva de calibrao
0 0,5 0,014 0,169
Amostra 1 2 3

Amostras
Massa 0,2 0,3 0,4 Diluio 10 10 10 Sinal 0,362 0,523 0,687

1
2 4 6

0,345
0,687 1,236 1,896

Branco

0,020

Correo do branco
Pb
2 y = 0.3104x + 0.026 R2 = 0.9988

Sinal (A)

1.5 1 0.5 0 0 2 4 Conc (mg/L) 6 8

Correo do branco
a) Ignorar completamente a correo (apenas com inclinao)

Amostras

Curva de calibrao
0 0,5 0,014 0,169
Amostra 1 2 3 Massa 0,2 0,3 0,4 Diluio 10 10 10 Sinal 0,362 0,523 0,687 conc mg/L 1.17 1.68 2.21

1
2 4 6

0,345
0,687 1,236 1,896

Branco

0,020

Equao 1: y = 0,3104 x

Correo do branco
b) Utilizar o intercepto da curva de calibrao como branco de calibrao

Curva de calibrao
0 0,014
Amostra 1 2 3

Amostras
conc mg/L 1.08 1.60 2.13

Massa 0,2 0,3 0,4

Diluio 10 10 10

Sinal 0,362 0,523 0,687

0,5
1 2 4 6

0,169
0,345 0,687 1,236 1,896

Branco

0,020

Equao 1: y = 0,3104 x + 0,0260

Correo do branco
c) Utilizar uma branco analtico para correo (sem intercepto da curva) Amostras
conc mg/L 1.10 1.62 2.15

Curva de calibrao
0 0,014
Amostra 1 2 3

Massa 0,2 0,3 0,4

Diluio 10 10 10

Sinal 0,362 0,523 0,687

0,5
1 2 4 6

0,169
0,345 0,687 1,236 1,896

Branco

0,020

Equao 1: y = 0,3104 x

Correo do branco
d) Utilizar ambos (branco da calibrao e branco de reagente) Amostras
conc mg/L
1.02 1.54 2.07

Curva de calibrao
0 0,014
Amostra 1 2 3

Massa 0,2 0,3 0,4

Diluio 10 10 10

Sinal 0,362 0,523 0,687

0,5
1 2 4 6

0,169
0,345 0,687 1,236 1,896

Branco

0,020

Equao 1: y = 0,3104 x + 0,0260

Fim...