Actualizacin de Mtodos de Susceptibilidad en el Laboratorio

Principios generales del mtodo de difusin de disco

Alcances y limitaciones Requerimientos Mantenimiento de los materiales

Preparado de las placas de agar

Preparacin del inculo e inoculado de las placas Colocacin de los discos

Lectura de resultados e interpretacin: las tablas de NCCLS

Problemas comunes

Principios generales del mtodo

Difusin de disco en placa (Bauer-Kirby)

Disco con antibitico

X mm

R I S A B-C D

Principios generales del mtodo

concentracin inhibitoria

Alcances y limitaciones

Mtodo MUY barato y verstil Resultados en un mximo de 24 horas No requiere equipo especializado

Fcil de leer y de interpretar

No se puede aplicar a bacterias de crecimiento lento ni a anaerobias

Algunas diferencias biolgicas sutiles no son detectadas

Requerimientos

Medio de cultivo Placas de petri

Placas con medio

Refrigerador

Cultivo Solucin salina

Inculo estandarizado
Hisopos Sensi-discos Aplicador Plantilla Estufa de cultivo

Cte. McFarland
colormetro

Refrigerador
(2-8 C)

calibrador

Mantenimiento de los materiales

Medio de cultivo deshidratado En lugar fresco y seco Frasco bien cerrado Cajas de petri 100 x 15 mm

Mueller-Hinton Mueller-Hinton + sangre 5% HTM

Usar el contenido completo de la bolsa (sacar solo las necesarias/cerrar bolsa)

Sensi-discos

En refrigeracin (2-8 C) En el blister intacto, o en un frasco o tupper con desecante, o en el recipiente del despachador con desecante activo

Preparado de las placas de agar

Reconstitucin del medio

Seguir las indicaciones del envase Usar agua destilada Hervir hasta disolver -oUse agua fresca Agitar BIEN despus de esterilizar No exceder tiempos/temperaturas No re-fundir ms de una vez Aadir suplementos ~50 C

Vaciado de las placas

Verifique que la mesa donde solidificarn las placas est nivelada.

Use un nivel de burbuja para verificar Use siempre la mesa verificada para dejar solidificar Desconfe de mesas recubiertas con acero o formica Preferentemente NO apile las placas solidificando

Preparacin del inculo e inoculado de las placas

Preparacin del inculo Partir SIEMPRE de un cultivo puro y fresco en medio no-selectivo

colonias aisladas

Suspensin en salina (0.85% NaCl)

cultivo en medio lquido

Constante de McFarland 0.5

Vaciado de las placas

Control de calidad Grosor

cada placa

4 (0.5) mm E. coli ATCC

Soporte de crecimiento
cada lote

Contaminacin
cada placa antes de usar

Si el Mueller-Hinton no es de una marca confiable, la variacin entre lotes es muy grande. Consulte el procedimiento de NCCLS para control de calidad

Preparacin del inculo e inoculado de las placas

La constante de McFarland 0.5 0.5 mL de BaCl2 0.048 M (1.175% BaCl22H2O) 99.5 mL de H2SO4 0.18 M (1%) Absorbencia a 625 nm 0.08-0.10

Mantener en oscuridad en tubos con tapa-rosca

Remplazar o verificar cada mes

Preparacin del inculo e inoculado de las placas

Inoculado de las placas

Suspensin bacteriana (<30 min)

Hisopo estril

Humedecer y exprimir

Hisopar la superficie en 3 direcciones (60 aprox.)

Colocacin de los discos

pero primero Llevar a temperatura ambiente (sacar del refrigerador 30 minutos antes de usar)

Evita la condensacin de la humedad ambiental en los discos frios, que podra humedecer al antibitico, hacindolo inestable.

Los discos de beta-lactmicos se daan con mucha facilidad al estar hmedos; los inhibidores de beta-lactamasas (clavulanato, tazobactam) son aun ms sensibles

Colocacin de los discos

Colocacin de los discos

La distancia mnima de centro a centro es de 22 mm Si coloca manualmente, use una plantilla En una placa de 100 mm no caben ms de 9 discos Discos muy cercanos a la orilla producen halos asimtricos Discos muy cercanos entre si producen halos empalmados

Precauciones especiales
Nunca re-posicione

No ponga juntos discos de antibiticos sinrgicos e.g., b-lact y b-lact+inh, b-lact y aminoglucsidos

Incubacin

Incube inmediatamente despus de colocar los discos (mximo, 1 hora despus)

Para las enterobacterias, 18-24 hs a 35-37C

Nunca ms de 24 horas

Puede incubar en CO2, en frasco o pouch GasPak.

Lectura de resultados e interpretacin: las tablas de NCCLS

El halo ms grande no es -siempre- el del antibitico ms efectivo Medir el halo, usando preferentemente un calibrador (vernier) Tambin se puede usar una regla transparente con marcas bien impresas. Registrar los dimetros de los halos como resultado primario

Lectura de resultados e interpretacin: las tablas de NCCLS

Hay variaciones de antibitico a antibitico, y tambin de bacteria a bacteria Resistente Intermedio 14-16 Sensible 17 29 17 30

Ampicilina enterobacterias estafilococos enterococos

estreptococos Piperacilina/Tazo enterobacterias P. aeruginosa

13 28 16 21

22-29

17 17

18-20

21 18

intermedio resistente

Control de calidad

Uso de cepas de ATCC (American Type Culture Collection) Permite saber si el mtodo en general est produciendo resultados confiables Debiera correrse el control en cada nuevo lote de medio y de discos, o al menos una vez cada 15 dias Escherichia coli 25922 Staphylococcus aureus 29213 Pseudomonas aeruginosa 27853 Escherichia coli 35218 productora de beta-lactamasa

Haemophilus influenzae 49247 Streptococcus pneumoniae 49619

Verifique que los valores caigan dentro de los intervalos correspondientes.

Problemas comunes

Colonias dentro de los halos Cultivo contaminado Variantes hiper-resistentes Halos difusos Proteus y su swarming Sulfonamidas y su efecto bacteriosttico Crecimiento pobre Probar diferentes ngulos de luz reflejada Inhibicin del crecimiento o de la hemlisis? El halo de hemlisis es siempre menor que el de inhibicin

Problemas comunes

Halos asimtricos Discos muy cerca de las orillas de la caja Efecto sinrgico Halos empalmados Gran susceptibilidad Discos muy juntos Dobles halos Cultivo contaminado Discos caidos No se presionaron bien contra la superficie del agar

Los mtodos automatizados

Principio general

.
0

.
1

.
2

.
4

.
8

.
16

.
32 g/mL

MIC

Los mtodos automatizados

fuente de luz

fotocelda

Los mtodos automatizados

Ventajas y limitaciones

Rpido (desde 4 horas) Menor tiempo de preparacin Resultados como MIC interpretados

Muy costoso Impide probar antibiticos distintos Requiere equipo dedicado Contaminantes pueden pasar desapercibidos Fallas difciles de detectar y solucionar

Los mtodos automatizados

Necesidad de control de calidad Fallas posibles Medio no soporta crecimiento Temperatura inadecuada Falla en fotoelementos Antibiticos degradados Diagnstico

Controles internos

Cepas ATCC

Fundamental cuando aparecen supuestos brotes de bacterias resistentes a combinaciones con inhibidores de beta-lactamasas, como el tazobactam.

Los mtodos automatizados

Precauciones especiales

Cuidar las condiciones de almacenamiento de los pneles o tarjetas

Mantener limpia la cmara del nefelmetro

Mantener discos y placas disponibles para control externo en caso de dudas

Categoras interpretativas de las pruebas de susceptibilidad

(NCCLS)

Susceptible (S), la infeccin debida a la cepa aislada puede tratarse con la dsis recomendada del antibitico Intermedio (I), la aplicacin clnica en sitios donde se concentre la droga o cuando se pueden usar dsis ms altas o es la zona de errores tcnicos incotrolados causa de las mayores discrepancias interpretativas Resistente (R ) cepas no inhibidas por concentraciones sistmicas usuales

Tabla interpretacin de la zona del dimetro de inhibicin para enterobacterias (NCCLS)

Valores lmite de cepas control de calidad para prueba de difusin con disco (NCCLS)

Conservacin de las cepas ATCC, control de calidad de susceptibilidad antimicrobiana.

Almacenamiento, mismo procedimiento que para aislamientos clnicos. Prolongado a -20C, preferentemente a -60C, caldo con suero fetal bovino al 50% 10-15% de glicerol con caldo soya tripticasa sangre de carnero desfibrinada leche descremada liofilizadas. Cultivos de trabajo: cepas no fastidiosas en agar soya tripticasa fastidiosas en agar chocolate a 2-8C, mximo una semana.

Qu hacer frente a resultados no comunes?

Evaluar contaminacin de la prueba No usar discos inadecuados o defectuosos Confirmar identificacin de la cepa Repetir prueba de susceptibilidad Buscar errores de transcripcin Buscar antecedentes de cepas similares confirmadas del paciente Enviar cepas al laboratorio de referencia

Nuevas recomendaciones NILS 2005

Salmonella y quinolonas
Probar cido naldixico en cepas extraintestinales de Salmonella spp sensibles a ciprofloxacino > 21 mm = sensible (difusin)

0.12 1.0 g/mL (CIM) < 1 = sensible

NNCLS recomienda.....
En cepas resistente a cido naldixico y sensible a fluoroquinolonas agregar el comentario:
El uso de fluoroquinolonas no erradica al agente, se recomienda interconsulta infectologca
M100.S14 (M2, M7); Tabla 2A

Prueba para evaluar resistencia inducible a clindamicina o D test

Difusin
Con discos de clindamicina (2ug) colocar de 15-26 mm del borde de un disco de eritro (15ug), Usar como controles cepas internas D test (-) y (+)

An no se ha seleccionado la cepa control de calidad a utilizar

Determinacin de de la resistencia inducible a clindamicina o D test

D test positivo

D test negativo

Recomendacin para determinar resistencia a clindamicina

Difusin: realizar D test a todas las cepas de Staphylococcus spp Dilucin (CIM): realizar D test a las cepas que resulten resistentes a eritro y sensibles a clinada

Informar
Eritro S R R Clinda S R Informe Sensible a ambas drogas

Resistente a ambas drogas D test (-) Resistente a eritro y sensible a clinda D test (+) Resistente a ambas drogas

Recomendaciones del NCCLS

En Staphylococcus es posible utilizar el disco de cefoxitina de 30ug y sus valores de corte para predecir la resistencia a oxacilina mediada por mecA (M100-S14 (M2,M7), Tabla 2C)

El disco de cefoxitina es mejor que los de oxa para detectar la oxa resistencia en S. aureus

El estndar de oro sigue siendo la deteccin de mec A (PBP 2A)

Disco de cefoxitina para deteccin de resistencia por mecA en Staphylococcus spp

Reemplazar el disco de oxacilina por el de cefoxitina (30ug) Incubar por 24h, si la cepa es resistente se puede detectar a partir de las 18h

Determinar si la cepa es resistente o sensible segn los valores de corte para cefoxitina En el informe reportar resultado para OXACILINA, no para cefoxitina

S. aureus oxacilina resistentes

Dimetro del halo de inhibicin (mm) cefoxitina 30ug

> 20
Informar oxacilino sensible

< 19

Informar oxacilino resistente

SCN oxacilina resistentes

Dimetro del halo de inhibicin (mm) cefoxitina 30ug

> 25
Informar oxacilino sensible

< 24

Informar oxacilino resistente

Determinacin de BLEEs

Determinacin de la produccin de BLEEs en K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli

NCCLS

Preparacin de discos de CAZ/ac. clavulnico y CTX/ac. clavulnico

Se preparan los discos a una concentracin 30 g/10 g (discos CAZ o CTX comerciales + ac. clavulnico) Discos comerciales de CAZ y de CTX con 30g Solucin stock del cido clavulnico 1, 000g/mL Adicionar 10 L del stocx por disco de CAZ o CTX Preparar una hora antes de aplicar a la placa No almacenar

Determinacin de la produccin de BLEEs de K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli

NCCLS

Produccin de BLEEs (+)

Determinacin de la produccin de BLEEs de K. pneumoniae, K. oxytoca y E. coli

NCCLS

Incremento > 5mm del dimetro de la zona de inhibicin del antibitico mas el inhibidor de -lactamasas respecto del antibitico solo indica que una bacteria es productora de BLEEs

Determinacin de la produccin de BLEEs prueba Etest

TZ/TZL > 8 = produccin de BLEEs

Determinacin de -lactamasas AmpC inducibles

Achatamiento de la zona de inhibicin alrededor del disco de ceftazidime debido a la induccin de AmpC por cefoxitina

Conclusiones
La eleccin adecuada de los antibiticos a probar contra un grmen infeccioso especfico es importante para la utilidad del resultado Para cada grupo de microorganismos se deben probar agentes que sean eficaces in vitro y en el tratamiento in vivo El procesamiento adecuado con un buen control de calidad hacen un reporte de susceptibilidad confiable de valor clnico, con implicacin en la minimizacin de emergencia de resistencia debida al uso inadecuado de antibiticos, estancias hospitalarias ms cortas y disminucin en el costo.

Disco de cefoxitina para deteccin de resistencia por mecA en Staphylococcus spp

Mecanismo de oxa resistencia Produccin de PBP 2a (gen mecA SAMR) Hiperproduccin de betalactamasas Alteracin PBPs preexistentes S.aureus + + + SCN + -

organismos Enterobacterias C. freundii, Enterobacter spp, S. marcescens,

Fenotipo inusual intermedio o resistente a carbapenen Sensible a ampicilina, o a cefalotina

Klebsiella spp, P. Sensibles a ampicilina vulgaris, Providencia spp

Determinacin de CIM por diluciones seriadas dobles en agar

Que diluciones se incluyen: la dilucin mas alta de la lnea de corte de resistencia para el tipo de m.o. en estudio de acuerdo al NCCLS y la dilucin mas baja de sensibilidad de la cepa control ATCC incluida Ciertos suplementos se aadirn al agar en determinados casos: NaCl (2% p/v) para pruebas con oxacilina, meticilina, para Staphylococci 5 % de sangre desfibrinada de carnero para grmenes fastidiosos que la requieren para su crecimiento ( S.pneumoniae).

Preparacin del medio como indica el fabricante

Despus de esterilizar por autoclave, se mantiene a 45-50 C, aadir aspticamente los antibiticos y suplementos. Colocar un volumen constante a placas Petri

Estandarizacin del inculo

Preparacin del inculo : al menos 3-5 colonias bien aisladas y misma morfologa se transfieren a 5 ml de medio de cultivo, se incuba y se compara la turbidez de la suspensin bacteriana con el estndar de McFarland 0.5 (1x108 UFC/mL). Se har una dilucin 1:10 (1x107 UFC/mL). Cuando 0.005 mL de esta suspensin es inoculada, la concentracin final de bacterias ser de 5x104 UFC/mL. Estndar de turbidez de Ba SO4 , equivalente a 0.5 de McFarland : 0.5 ml de BaCl2 (1.175 % p/v Ba Cl2 x 2H2 O) + 99.5 mL de H2SO4 (1% v/v) (Abs625= 0.08)

Concentracin Mnima Inhibitoria

La CMI est entre la concentracin mas baja del antibitico que inhibe el crecimiento del m.o. y la siguiente concentracin donde es visible el crecimiento

Mtodos de dilucin en caldo: macro y microdilucin

Medio recomendado (NCCLS): caldo Mueller-Hinton estril en tubos de 13x100. Soluciones stock de antibiticos esterilizadas por filtracin. Diluciones dobles seriadas con el antibitico preparadas volumetricamente Adicin constante de inculo estandarizado Uso de tubo control de esterilidad con caldo sin antimicrobiano

MACRODILUCIN EN CALDO

Microdilucin en caldo
Involucra el uso de pequeos volmenes de caldo (100 L x pozo) en microplacas de 96 pozos.

NCCLS: Diluciones seriadas del antimicrobiano a la concentracin deseada con 50 L por pozo y llenando hasta 100 L
El ensayo deber incluir pozos control de crecimiento (control positivo de crecimiento y control negativo de caldo sin inculo) NCCLS: que el volumen no exeda el 10 % del volumen del pozo (< 5 L de inoculo en 100 L de solucin) Prevenir desecacin de la placa

Microdilucin en caldo
Margen de error mayor cuando se usan 5 L del inculo. Modificacin : usar un volumen de 50 L.

Densidad del inculo comparado con 0.5 McFarland = 1.5x108 UFC/mL dilur 1:100 tomar 50 L para inocular cada pozo= 7.5x104 UFC/mL Stock de antibitico: 10 veces ms (1280) de la concentracin ms alta a usar (128)
De 1280 dilur 1:5 = 256 a partir de esta concentracin diluciones seriadas dobles con volumen final de 50 L : 256 128 64 32 16 8 4 2 1 + 50 L de inculo: 128 64 32 16 8 4 2 1

Microdilucin en caldo

La CIM es la concentracin mas baja del antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento del m.o. en el pozo comparando con los pozos control (crecimiento negativo y positivo)

Susceptibilidad antimicrobiana por E-test

Prueba comercial, principio de difusin con disco. Provee un resultado cuantitativo de CIM

METAS DEL CONTROL DE CALIDAD:

Mantener precisin y exactitud del procedimiento usado para las pruebas de sensibilidad Uso de cepas de referencia (ATCC) seleccionadas por su estabilidad gentica y utilidad para control del mtodo

Reproducibilidad del mtodo

Uso de puntos de corte bien establecidos (Tablas NCCLS), con calidad aceptable de los reactivos usados

INFORME DE RESULTADOS
Un informe adecuado incluye la correcta seleccin de los antimicrobianos probados, trabajo conjunto del laboratorio clnico, mdico consultante y comit de control de infecciones. Los antimicrobianos indicados por NCCLS son los de eficacia clnicamente aprobada para los distintos m.o.

CONCLUSIONES:
La correcta determinacin de susceptibilidad a un nmero limitado de drogas, ayuda al uso adecuado de antimicrobianos, minimizando la seleccin de cultivos nosocomiales multirresistentes.
La CIM obtenida usando mtodos estandarizados, dice al Mdico la concentracin del agente antimicrobiano necesaria para inhibir la infeccin del m.o.