Treinamento Colunas Cromatogrficas

Objetivo
Padronizar a correta utilizao, cuidados e acompanhamento da performance das colunas cromatogrficas

Definio
Compreende como a fase estacionria na cromatografia lquida. A fase estacionria constituda ou por um slido finamente dividido ou por um lquido impregnando um suporte slido ou por um slido modificado quimicamente por introduo de grupos orgnicos. A fase estacionria responsvel por reter o soluto devido sua adsoro, partio, troca inica ou pela permeao em gel. Sendo os mais usados a separao por adsoro e por partio
.

Recebimento das Colunas

Verificao

de acordo com a solicitao Codificao. Ex : DMA001 Arquivar o certificado de anlise

Cuidados e manuseio das Colunas

Evitar mudanas drsticas de fluxo e tipos de solventes; Utilizar sempre pr-coluna quando tiver; Filtrar e degaseificar a fase mvel; No expor as colunas a temperaturas maiores que 60C; Evitar colises e quedas das colunas

Cuidados e manuseio das Colunas

No submeta a coluna a pHs extremos se no for estritamente necessrio; Nunca armazene ou estoque a coluna em solues tamponadas;

Utilize somente solventes grau HPLC;

Limpeza
Sequncia de Limpeza para Colunas: C18/C8 e Fenil:
TEMPO COMPOSIO DO SOLVENTE 0 a 15 minutos 16 a 30 31 a 45 46 a 60 minutos GUA: METANOL (90:10) 100% METANOL 100% ACETONITRILA GUA: ACN (20:80) 1mL/min 1 mL/min 1 mL/min 1 mL/min FLUXO

Limpeza
Sequncia de Limpeza para Coluna Si/CN:
TEMPO COMPOSIO DO SOLVENTE 0 a 15 minutos 16 a 30 HEXANO 100% ISOPROPANOL 100% 1mL/min 1 mL/min 1 mL/min 1 mL/min FLUXO

31 a 45 46 a 60 minutos

ETER 100% HEXANO 100%

Limpeza
Qual a forma correta de lavar uma coluna RP aps a utilizao de uma fase mvel composta por tampo? gua, Metanol ou Acetonitrila???? Qual proporo??? Validade fase mvel???

Limpeza cida
feita com os mesmos parmetros utilizados na limpeza de rotina, alterando somente os tipos de reagentes:

Metanol Clorofrmio Metanol H2SO4 0,05M ACN

gua

Limpeza cida
Quando

realizada? Quais os cuidados em relao aos reagentes utilizados?

Regenerao Colunas
Antes

de proceder regenerao de uma coluna, certificar-se que somente com a limpeza no alcance o resultado esperado. Caso haja problema de presso alta passar primeiramente gua a 50C, com vazo baixa pelo tempo que se julgar necessrio. Se esses procedimentos no apresentarem bons resultados, proceder primeiramente com a sequncia cida, se no houver o resultado desejado, proceder com a regenerao especfica para a coluna.

Regenerao Colunas
Para a coluna de Si, no realizar a limpeza cida, se for necessrio proceder diretamente a regenerao especfica; Toda regenerao dever ser registrada no formulrio de registro e acompanhamento da vida til da coluna cromatogrfica,conforme anexo I do procedimento.

Regenerao de Colunas
Condies Gerais: Para regenerar uma coluna danificada (baixa seletividade, eficincia e simetria) proceder da seguinte forma: Colunas de 100, 125 e 150 x 4,0 e 4,6 mm: Condio de regenerao: 20 minutos por componente com vazo de 1 mL/min; Colunas de 250, 300 x 4,0 e 4,6 mm: Condio de regenerao: 40 minutos por componente com vazo de 1 mL/min.

Regenerao Colunas
FASE REVERSA C8/C18 e Fenil: gua quente (50C) Metanol ACN THF Etanol gua ACN FASE NORMAL CN: Heptano Clorofrmio Acetato de Etila Acetona Etanol gua ACN FASE NORMAL Si: Hexano Cloreto de Metileno Clorofrmio Cloreto de Metileno Hexano

Qualificao de Performance
Processo empregado para verificao da eficincia da coluna cromatogrfica, onde so analisados alguns parmetros como assimetria, resoluo, nmero de pratos tericos, verificando dessa forma se a coluna atende aos requisitos farmacopicos para anlise.

Avaliao da Performance Colunas

Seguir o procedimento de anlise e as seguintes especificaes:

Assimetria:

0,8 a 1,8 Pratos tericos: no menos que 2000. Desvio padro relativo: no mais que 2,0%

Qualificao de Performance
Quando

os resultados obtidos em anlise no estiverem dentro dos parmetros estabelecidos para anlise realizar uma investigao de todos os procedimentos analticos para confirmao de problemas especficos da coluna.

Qualificao de Performance
Caso haja necessidade de regenerao, proceder conforme procedimento de regenerao e logo aps, realizar uma nova qualificao de performance para essa coluna e anexar os resultados na pasta de verificao de performance de colunas cromatogrficas.

Qualificao de Performance
Preencher o formulrio de qualificao conforme o modelo juntamente com os cromatogramas de qualificao. Aps a realizao da qualificao deve ser preenchida uma etiqueta fixada na caixa da coluna cromatogrfica.

Consideraes Importantes
Coluna o corao do sistema, As trs principais razes para falha em coluna reversa so: perda de fase ligada; Vazios na coluna; Contaminao coluna

Consideraes Importantes
Quando uma coluna est ligada pela primeira vez, ou aps ter sido armazenado por um longo tempo, ele precisa ser ativada. Nesta fase, recomenda-se que no deve ser conectada para o detector ainda, mas para deixar o solvente eluir fora livremente por 5 minutos para liberar partculas que pode ser liberado devido a problemas de embalagem, ou mesmo do ar.

Consideraes Importantes
Perda de fase ligada: A medida que fase ligada removida do suporte de slica, tempos de reteno e resoluo mudaro e picos do mais cauda. Causa: Hidrlise siloxane da fase ligada ou reagentes. Preveno: Opere com fase mvel de pH acima de 2 e temperatura menor que 60C

Consideraes Importantes
Vazios

na Coluna: Picos decrescem,alargam, eluem com cauda ou dividem. Causas: Colunas mal empacotadas, que se assentam durante o uso,dissoluo de slica por operao de pH elevado,aumento brusco da presso, colises.

Consideraes Importantes
Preveno: Mantenha a presso abaixo de 4000 psi e elimine grandes aumentos de presso; Compre colunas de qualidade;

Consideraes Importantes
Contaminao na Coluna: Incrustaes na coluna resulta material retido, isto pode conduzir a deslocamento da reteno do pico. Como por exemplo: materiais particulados ou amostras precipitadas e tampes. Causas: Impurezas na fase mvel, que adsorve na fase estacionria, comum quando uma on-par e outros aditivos;

Consideraes importantes
Preveno: Limpe as amostras, antes da injeo, isto pode incluir filtrao das amostras; Rotineiramente passe solvente forte atravs da coluna; Troque sempre frit

Consideraes Importantes
Eventualmente todas as colunas perdem o desempenho e devem ser substitudas. O tempo depende das condies cromatogrficas usadas, bem como da prpria coluna. Monitorando o desempenho da coluna pode-se saber se ela iniciou a se deteriorar e prever quando deve ser substituda.

Mensagem Final
anjos de uma asa s e s podemos voar se abraarmos uns aos outros
Somos

Questes????????
cfonseca@lbaldacci.com.br