Tinciones Diferenciales

Prcticas de Laboratorio II
Dr. Jos Magarios Tc. Luciano Rey Tc. Beln Manrique

Tinciones diferenciales
Como su nombre lo indica, nos permiten diferenciar entre grupos de bacterias que tienen distintas propiedades tintoriales Las tinciones diferenciales ms comnmente utilizadas son la tincin de Gram y la tincin de Zie l!"eelsen

Tincin de Gram
La tincin de Gram. ue desarrollada emp!ricamente por # ristian Gram en "##$, a pesar del tiempo transcurrido la tincin apenas se %a modificado & es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana. La t'cnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias( Gram $ositi%as y Gram negati%as.

&undamento de la Tcnica
La diferenciacin entre las bacterias Gram positi)as & Gram negati)as se establece en la naturaleza & caracter!sticas de la $ared celular 'acteriana. Las bacterias Gram positi)as poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al comple*o colorante+ mordiente ,cristal )ioleta+&odo-. .urante la decoloracin con alco%ol acetona se pro)oca una des%idratacin de esta gruesa pared & se reduce la porosidad, atrapando entonces al comple*o en el interior de la c'lula. Las bacterias Gram negati)as, poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del comple*o colorante+ mordiente ,cristal )ioleta+&odo- & es entonces fcilmente te/ida por el colorante secundario o de contraste.

Resultados de la coloracin
Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente se refiere difieren en el color con el que finalmente se ti/en las bacterias. Gram $ositi%as se obser)arn de azul por el cristal )ioleta & no perdern esta coloracin durante los pasos sucesi)os. Las bacterias Gram negati%as perdern la coloracin inicial con los siguientes pasos & se te/irn de rosa debido a la 0afranina.

La diferencia esta determinada por la composicin de su en)oltura celular, las bacterias Gram. positi)as poseen una malla de p'ptido glicano en su parte mas e1terna ,mientras que las Gram. negati)as recubriendo una fina capa de peptidoglicano & presentan una membrana e1terna .

Reacti%os y #olorantes
La tincin de Gram. requiere cuatro soluciones( (. )rimer colorante. 2n colorante bsico ,3- que en contacto con las c'lulas cargadas negati)amente, reacciona con ellas colorendolas. 4l mas utilizado es el cristal )ioleta. *. +olucin mordiente. i*a las tinciones & aumenta la afinidad entre el colorante & las c'lulas. Los mordientes usados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como por e*emplo, una sol. diluida de &odo. ,. -gente decolorante. 4s un disol)ente orgnico5 por e*emplo alco%ol acetona ,"("-. .. #olorante de contraste. 4s un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como por e*emplo, la 0afranina.

)rocedimiento Tcnico
"76ealizar el e1tendido de la muestra i*acin del e1tendido
Mtodos f/sicos0 accin del calor Mtodos qu/micos0 metanol

8$<=-

Primer colorante( cristal )ioleta 9ordiente( Lugol ,sc I7:;I.ecoloracin( mezcla alco%ol+acetona "(" 0egundo colorante( safranina

)rocedimiento Tcnico

Diferencias entre Gram 123 y 1!3

Morfolog/a Bacteriana

Tincin de Zie l!"eelsen

La tincin de >ie%l?@eelsen desarrollada inicalmente por Paul 4%rlic% para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de tuberculosois en muestras cl!nicas de pacientes es otra mu& importante tincin diferencial. La t'cnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias( B--R $ositi%as y B--R negati%as. BAAR: bacilos cido alcohol resistentes

&undamento de la Tcnica
Las paredes celulares de ciertos parsitos & bacterias. contienen cidos grasos ,cidos miclicos- de cadena larga ,<A a BA tomos de carbono- que les confieren la propiedad de resistir la decolorac!n con alco%ol+cido, despu's de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido+alco%ol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis & M. marinum & los parsitos cocc!deos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de cido+alco%ol resistencia. La coloracin clsica de >ie%l+@eelsen requiere calentamiento para que el colorante atra)iese la pared bacteriana que contiene ceras. Cl suspender el calentamiento & enfriar con agua, pro)oca una nue)a solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante &a no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energ!a cin'tica de las mol'culas del colorante lo cual tambi'n facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color ro*o & la que no se )en de color azul.

)rocedimiento Tcnico
"78$Dacer un frotis 0ecar al aire & fi*ar por calor Cubrir todo el porta+ob*etos con fucsina fenicada Calentar sua)emente con el mec%ero %asta la emisin de )apores. <4l colorante no debe secarse ni %er)ir, a/adir ms si es necesario. =9antener la emisin de )apores durante < minutos. ELa)ar con un c%orro sua)e de agua. #.ecolorar con alco%ol cido BLa)ar con agua "A- Cubrir el frotis con azul de metileno & de*arlo actuar durante un minuto. ""- La)ar con agua, escurrir & de*ar secar al aire Fbser)ar al microscopio con el ob*eti)o de inmersin Las bacterias >@3 o GCC6 se obser)arn te/idas intensamente de color ro*o.

9&cobacterium tuberculosis

Tinciones +electi%as
Las tinciones selecti)as nos permiten obser)ar estructuras de las c'lulas gracias a su ma&or afinidad por los colorantes utilizados 0e pueden obser)ar estructuras como la pared celular, cpsula, flagelos, material nuclear, e inclusiones como depsitos de materiales de reser)a de poli+H+%idro1ibutirato, glucgeno & grnulos metacromticos

#oloracin de es$oras
Clgunas bacterias son capaces de desarrollar formas de resistencia denominadas esporas como mecanismo de defensa a agresiones ambientales. 0on estructuras de pared gruesa en las que el microorganismo logra soportar las condiciones desfa)orables de calor, desecacin, acidez, etc. Cuando las condiciones ambientales )uel)en a ser fa)orables las esporas IgerminanI & )uel)en a generarse formas )egetati)as. Por ese moti)o, las endosporas son im$ermea'les a los colorantes, por lo que cuando se %ace una tincin, se obser)an al microscopio como cuerpos altamente refringentes & sin te/ir. 0in embargo, las endosporas se pueden te/ir aplicando calor a la preparacin pre)iamente cubierta con una solucin de colorante que en la t'cnica de 0%aeffer & ulton es el )erde de malaquita. 4l la)ado con agua elimina este colorante de las c'lulas )egetati)as & la aplicacin de un colorante de contraste permitir distinguir claramente a las esporas de color )erde.

4ndos$oras en las 'acterias

#oloracin de la c5$sula
Clgunas bacterias presentan una capa e1terna a la pared denominada cpsula. 4st compuesta de azcares & prote!nas. @o es una estructura )ital para la bacteria, de modo que es posible que ba*o determinadas condiciones ambientales o del propio desarrollo genere cpsula & ba*o otras no lo %aga. 0e %a comprobado que la presencia de cpsula dificulta de algn modo la fagocitosis de las bacterias, es decir las cpsulas constitu&en un factor de )irulencia de los microorganismos. La tincin de cpsula se denomina tincin negati)a porque ti/e el fondo de la preparacin & no el microorganismo. .esde el punto de )ista formal no es una tincin propiamente dic%a, porque no fi*a los microorganismos. 0e parece ms a una preparacin en fresco. 0u realizacin es sencill!sima, consiste en colocar la muestra %meda sobre el porta ob*etos & mezclarla con tinta c%ina. La tinta cubre toda la preparacin a e1cepcin de las cpsulas. 4n el microscopio se obser)a el fondo negro & los microorganismos con cpsula sin color.

)rocedimiento Tcnico
Mtodo de la tinta c ina $ara c5$sula ".+4n el centro de un portaob*etos se coloca una gota de agua, otra de tinta c%ina & un poco del culti)o de una cepa capsulada. 0e mezcla sua)emente sin e1tender. 7.+0e coloca un cubreob*etos sobre la suspensin & se presiona sua)emente e)itando que queden burbu*as. 8.+Fbser)ar inmediatamente al microscopio. $.+.esec%ar la preparacin en un recipiente con antis'ptico. La cpsula se obser)a como una gran estructura alrededor de la c'lula delimitada por los peque/os fragmentos de carbn de la tinta c%ina.

#5$sulas 'acterianas