Gentica y Biologa Molecular en Bioqumica

Expresin gentica

Ricardo Fujita, Ph.D. Centro de Gentica y Biologa Molecular Instituto de Investigacin Facultad de Medicina USMP

Hibridacin/Denaturacin
Agentes qumicos, alta temperatura, baja salinidad

Se rompen los enlaces de hidrgeno y se separan las cadenas

SONDA

Dos cadenas se aparean por reconocimiento de bases y vuelven a formar enlaces de hidrgeno

Hibridacin DNA marcado fluorescencia (sonda)

Tcnica Fluorescence in situ hybridization FISH (localizar genes en regiones cromosmicas)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) en interfase

Ncleo hibridado con sondas fluorescentes con secuencias de crom 21 (rojo) y 5 (verde)

Clula con 2 cromosomas 5 y 3 cromosomas 21

Fluorescence in situ hybridization (FISH) en metafase

Deteccin de delecin de gen esteroide sulfatasa (STS) en cromosoma X Sonda fluorescente para centrmero X (Control) y para secuencias STS. Ictiosis ligada al X, indicador de deleciones otros genes vecinos: Kallman, RM, chondrodysplasia punctata, albinismo ocular

Sondas de 4-5 colores 23 cromosomas

Cariotipo espectral SKY

Anlisis SKY en tumores A mas rearreglos peor pronstico

Anlisis Southern Blot

DNA es cortado con enzimas de restriccin

Bsqueda de una secuencia entre miles, usando un segmento de DNA sonda marcada

Southern blot (continuacin) Hibridacin con sonda segmento de DNA especfico (200-500 bases)

Edwin Southern Northern blot RNA Western blot Protenas

Anlisis de Southern Blot: Prdida de Heterocigocisidad en carcinoma de vejiga con sonda de gen LPL del cromosoma 8
Sangre Tumor
Sitios normales de enzimas de restriccin

Alelo 1 Alelo 2
Sonda LPL Polimorfismo de restriccin Restriction fragment length polymorphism

Microarrays (Edwin Southern)

Genmica: Permite analizar cientos de muestras a la vez Varias formas DNA, copy number variation, RNA, protenas Ejm. variacin nmero copias

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velcro molecular

Estructura Genoma Humano

22 pares autosomas + XX/XY 3.2 X 109 pares de bases (bp) haploide < 25,000 genes traducidos, > de 300,000 protenas. Genes segmentados => Splicing alternativo: 1 gen varias protenas segn tejido Solo 1.3% traducido a proteinas Conservacin en secuencias codantes (>>), regulatorias (>) y no codantes (<) Varios segmentos de varios Kb-Mb del genoma repetidos en diferentes regiones

Repeticin de Secuencias
Secuencia nica: exones de genes nicos, ejm. gen de distrofina, insulina Medianamente repetida: Algunas copias-decenas: familia de genes : origen comn y conservacin de secuencias (poca variacin), ejm. Globinas de sangre (a,b,g,d,e), actinas, colgenos, CYP450, Cientos de copias: rRNA, histonas (necesidad de muchas copias en poco tiempo) Altamente repetidas miles de copias En tndem: Telmero, Centrmeros, microsatlites Cicatrices de inserciones de retrotransposones (SINE short interspersed nuclear elements- Alu), retrovirus (LINE long interspersed nuclear elements).

Secuencias altamente repetitivas en tandem

DNA satlite: concepto bioqumico, diferente densidad que el resto. Localizado en centrmeros, rico en repeticiones A:T Telmeros repeticiones (TTAGGG)n, polimerizados por TELOMERASA Minisatlites: secuencias de 6 - 200 bp, repetidas 2 a 10 veces y en tandem Microsatlites: secuencias de 2 a 5 bp, repetidas de 2 a 20 veces y en tandem

Secuencias altamente repetitivas en tandem

DNA satlite DNA principal DNA satlite: centrmeros, rico en repeticiones miles de veces en tndem Telmeros repeticiones (TTAGGG)n en tndem, polimerizados por TELOMERASA Microsatlites: secuencias de 2 a 5 bp, repetidas de 2 a 20 veces y en tandem. Miles repartidos en todas las regiones cromosmicas.

Esquema de un microsatlite

La regin flanqueante es idntica en todos los humanos, el nmero de unidades del tandem es variable y heredado

Segregacin de alelos de microsatlites en una familia

Usado para identidad gentica (patermidad) y mapeo de genes

Segregacin de un marcador polimrfico microsatlite

Cada persona recibe un alelo de cada progenitor

Expansin de triplete CAG en el gen de la Enfermedad de Huntington n 40 36

(CAG)n

67

Figura 2. Diagrama del gen HD (IT15) que tiene 67 exones y est ubicado en el brazo corto del cromosoma 4 (4p16). Su protena producto (huntingtina) es rica en glutaminas Una mutacin en el exn 1 causa la enfermedad de Huntington, la regin rica en el trinucletido (CAG) provoca la enfermedad siempre que pasa de 40 repeticiones. Fujita, 2000. Revista Diagnstico 39 (6): 3113-20.

Anlisis del gen de corea de Huntington (cromosoma 4) Expansin de tandem (CAG)n Poli (Glu) en exn 1 * Umbral afectados (> 40) Umbral normal (< 40)

*
P= Paciente 1 alelo > 40 y otro < 40 N = Normal (todos < 40) * Hurtado, Zambrano, Guevara, Fujita (2003) Horizonte Mdico Vol 3: 43-47. * * * * * * *

Secuencias altamente repetitivas esparcidas

Cicatrices de retrovirus y transposones No estn repetidos en tandem, sino unidades esparcidas SINE (short interspersed nuclear elements): Secuencia recuerda transposn Consenso ~ secuencia de 300 bp o menos Ms conocida familia Alu ~ 500,000 copias LINE (long interspersed nuclear elements): Secuencia recuerda retrovirus consenso algunos cientos de bp de~ 6-7 kb Ms conocida familia Kpn

Origen del Polimorfismo I/D de la Enzima Convertidora de Angiotensina (ECA/ACE) Insercin 289 pb (Alu)
Alelo I (479 pb)

Alelo D (190 pb)

Homocigoto DD elevado ECA circulante (HTA?, cardiovasculares?) Fig. 1b. Anlisis del Polimorfismo I/D en 19 individuos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Origen electroforesis 479 bp 190 bp

DD II ID
Lizaraso, Medina, Salazar, Armas, Diestfano, Hurtado y Fujita (2003) Diagnstico 42:7-16.

Familias de genes

Genes originados por duplicacin y mutacin: histonas, globinas, CYP450, queratinas, PKAs, etc. Bsqueda de nuevos genes de secuencia parecida

Permanente

Programa

Ejecucin
Temporal

Estructura Primaria del RNA

Estructura Secundaria del RNA (hairpin-gancho de pelo)

Estructuras del RNA

Estructura cuaternaria

mRNA rRNA tRNA Ribozimas: RNA enzimtico (cataltica) RNA pequeos (small RNA sRNA): Parte de ribonucleoprotenas asiste reacciones de cidos nucleicos. ejm. Splicing (sNRP-small nuclear ribonucleoprotein). RNA inactivadores controlan regiones (no traducidos): XIST (X inactif specific transcript): Inactivacin del cromosoma X H19: RNA exceso promueve cncer esofgico y colorrectal, embrin normalmente solo materno RNA de interferencia-silenciamiento (RNAi/RNAsi): detecta RNA doble cadena (virus) y lo destruye Micro RNA (miRNA): RNA con secuencia parecida (no idntica) a mRNA blanco (target) para regularlo.

Funciones RNA

RNA de interferencia (RNAi) Premio Nobel de Medicina 2006

Mecanismo contra algunos virus y transposones (doble hebra RNA). Funciona naturalmente en plantas, insectos, nemtodos, mamferos. Cadenas de RNA doble hebra (>200nt) con secuencias de genes que se quiere silenciar Sistema de reconocimiento de la secuencia del primer RNA (1era etapa) Silenciar (destruccin) un segundo RNA especficamente por la secuencia reconocida (2da etapa) Se puede usar en mRNA de tumores

Premio Nobel Qumica 2009 Estructura de ribosomas

Estructura de los ribosomas: RNA + protenas ribonucleoprotenas Funcin de los ribosomas Antibiticos: accin de aminoglicsidos, tetraciclinas, espectinomicina, macrlidos, quetlidos, lincosamidas

Diferencia entre transcripcin mRNA eucariote/procariote

1 2

Procariotes: colinearidad DNA:RNA:Protena

Eucariotes modificacin: 1) CAP 2) Empalme (splicing) 3) Cola poli A

RNA polimerasas
Necesitan seales de reconocimiento (en DNA): inicio, final, regulacin Necesitan una plantilla de DNA: 5 -------------------------------------> 3 tira codificadora 3 <------------------------------------- 5 tira plantilla 5 -------------------------> 3 RNA NTP (ATP, CTP, GTP, UTP) Complejos proteicos: RNA + factores de transcripcin (protenas activadoras)

Promotor bacteriano
Caja TTGA Caja TATA

(A/G)

La transcripcin no se produce en cualquier punto, solo en inicio de genes Promotores: secuencias que indican el sitio y la frecuencia de fijacin de la RNA polimerasa en la plantilla DNA

Terminacin de la transcripcin
Sector del molde rico en A es transcrito a secuencia rico en U (a) Formacin de horquillas por la unin de G-C (amarillo) (b) c) Enlaces A-U son inestables y conllevan a disociacin, liberando transcrito primario (c)

(a)

(b)

(c)

Transcripcin en eucariotes
Tres polimerasas principales, muchas subunidades, factores y elementos reguladores RNA pol I: rRNA (28S, 18S y 5.8S) RNA pol II: hnRNA/mRNA, snRNA RNA pol III: tRNA, 5S rRNA, snRNA

Transcripcin y procesamiento de un gen tpico eucariota

Promotor Inicio
Zona Reguladora Fin

Intrn

Exn
DNA

transcrito
5UTR 5 untranslated region

hnRNA mRNA
3UTR

Transcripcin: DNA (ACGT) => RNA (ACGU)

Procesamiento del precursor-mRNA

En ncleo. Slo mRNA maduro a citoplasma (R.E. para protenas) Transcripcin primaria: RNA heterogneo nuclear (hnRNA): exones + intrones. Vara de <1 Kb a >2 Mb (distrofina) Modificaciones para tener mRNA maduro: CAP: (5-m7G) extremo 3

Cola Poli A, extremo 5

Splicing: empalme de exones, interno

CAP (capuchn)
3 5 Pu G 5 Modificacin en 5` Adicin guanina-metilada de cabeza

Funcin del cap

Proteger 5-mRNA- de exonucleasas Facilitar el transporte del ncleo a citoplasma Facilitar el splicing (empalme) Reconocimiento por la subunidad 40S rRNA para sntesis de protenas

Poliadenilacin (cola poli A)

Final gen RNA secuencia de terminacin: AAUAAA Contina polimerizando varias centenas o kbs en 3 (corriente abajo-downstream) Corte 15 a 30 nt. despus de AAUAAA Adicin de ~ 200 adeninas por poli (A) polimerasa

Adicin de poli A

RNAPol II

endonucleasa

seal
Cientos o miles nt

poli(A) Pol

200 nt

Posible rol de poli (A)

Facilitar transporte al citoplasma Alargar la vida til del mRNA (ms As, ms tiempo) Reconocimiento por la maquinaria de traduccin (ribosomas)

Splicing (empalme)
>> genes eucariotes interrumpidos
Exn: secuencia codante (80-120 nt) Intrn: secuencia interruptora (promedio 10,000 nt)

Eliminacin intrones en ncleo Spliceosoma (empalmosoma) complejo de protenas y RNAs (hnRNA-SnRNAs) Transporte al citoplasma solo como mRNA

CPuAPy

Branch site 20-50 nucletidos del final 3 del intrn

Branch site

Gen RPGR-cromosoma X Exon 14

Intrn 13

Genmico RT-PCR (mRNA) Fujita et al., 1997 Am. J Hum Genet 61: 571-580

Mutacin IVS 14 -7 ttcaaaaaatttacagAAA CAA

ttcaaaaagtttacagAAA CAA
Fujita et al., 1997 Am. J Hum Genet 61: 571-580

Empalme alternativo
Dogma antiguo: 1 gen (mRNA) = una protena=> falso Ser humano ~ 25,000 genes, Drosophila melanogaster 13,000, Caenorrhabditis elegans 18,000. Ser humano ms de 300,000 protenas distintas 1 gen = diferentes protenas depende de tejido: diferente combinacin de exones

Empalme alternativo del gen Calcitonina

DNA 5 3

hnRNA 5

Calcitonina

CGRP

AoB C D

Calcitonina

AoB C D

CGRP

Traduccin y procesamiento

Tiroides
Calcitonina 32 aa

Hipotlamo
CGRP 37 aa (calcitonin gene related protein)

El pre-mRNA de la tropomiosina es empalmado en de manera distinta para diferentes tejidos resultando en 5 distintas protenas.

Especificidad de tejidos en expresin de genes

Clulas del cuerpo humano: Genticamente clones Fsica y funcionalmente distintos 2 tipos principales de expresin: Genes de mantenimiento (housekeeping): todas clulas, genes metabolismo de azcares, nucletidos, aminocidos, microtbulos Genes especficos de tejido: solo en algunas clulas: insulina, rodopsina, globinas

Porqu con la misma informacin gentica hay tantos diferentes tejidos y clulas?
Protenas y mRNAs se van distribuyendo de manera diferente an cada clula hija

Control de la transcripcin
Especificidad: tiempo, tejido, condiciones ambientales Secuencias de DNA: promotores, elementos de respuesta (cajas), amplificadores Seales externas al gen: Factores de transcripcin (protenas especficas), metabolitos.

Regulacin en genes eucariotas

Procariotes: opern RNA pol compleja, varias subunidades Secuencias DNA: promotoras (cerca), reguladoras (cientos a miles de bases) Expresion basal y regulada Depende de estado compactacion de cromatina Metilacion de DNA (epigentica) Modificacion de histonas (epigentica)

Control de transcripcin en RNA pol II (eucariote) Cajas (secuencias de regulacin)

(A)

Varios cientos-algunos kb Corriente arriba o abajo exn 1 Especfico tejido, momento, estmulo

15-500 bp Todos (reconocimiento RNA pol)

Factores de expresin especfica de tejidos

Compactacin de cromatina y expresin

Corpsculo de Barr-cromatina sexual Gen expresado: cromatina laxa, gen inactivo: cromatina compacta Depende de histonas Histonas sufren modificaciones covalentes (acetilaciones, metilaciones y fosforilaciones) para su expresion/silenciamiento

ROL DE LA METILACION EN EL DNA En eucariotes, nica base modificada- 5meC (del

dinucletido CpG minipalndromo). De 2 a 7 % de las C En general metilacin del promotor inhibe la transcripcin a RNA, asociado a inactivacin de genes Epigentica Patrn de metilacin establecida en el des Los promotores de genes de mantenimiento NO metilados, los de genes especficos metilados en los tejidos que no producen sus protenas.

Expresin de genes por metilacin

Organizacin del material Gentico

Compactacin de histonas y expresin de genes

Mientras mas apretado el DNA a las histonas menos expresin. El DNA metilado recluta protenas (MBD) que a la vez reclutan protenas que deacetilan (AC) las histonas (HDAC)