Presencia de ADN bacteriano en el tejido valvular de pacientes con cardiopata reumtica crnica

Cardiopatia Reumatica
DEFINICION La cardiopata reumtica es una enfermedad caracterizada por dao en forma permanente a las vlvulas del corazn es la manifestacin ms severa de la carditis reumtica la cual es una enfermedad autoinmune !ue ocurre como una secuela tarda no supurativa de infecciones del tracto superior por el estreptococo "# $emoltico del %rupo &' En la cardiopata reumtica se produce dao a las vlvulas cardiacas !ue lue%o cicatrizan se deforman ( pierden su funcionamiento' &fecta particularmente a la vlvula mitral'

)ipotesis
&l ca*o de d+cadas de investi%aciones a,n no se esclarecen los mecanismos por los cuales el E"-& conduce a la CRC ( a sus secuelas valvulares.' Estudios clsicos $an demostrado !ue la respuesta inmune en pacientes con ER& se caracteriza por!ue sus componentes celulares/ ( $umorales0 reconocen tanto al E"-& como al te1ido cardaco $umano23 22' Este fenmeno de reactividad cruzada es el fundamento de la teora de la mmica molecular !ue invoca la seme1anza estructural entre el a%ente causal ( los te1idos del $u+sped como mecanismo desencadenante de autoinmunidad '

4or estas razones

planteamos !ue el E"-& pudiese efectivamente persistir en el te1ido valvular de pacientes con CRC ( a*ordamos esta $iptesis investi%ando mediante la reaccin de polimerasa en cadena (PCR) la presencia de &DN *acteriano en las vlvulas de pacientes con CRC sometidos a ciru%a de reemplazo valvular'

Pacientes
5e analizaron muestras de te1ido valvular de 26 pacientes con CRC sometidos a ciru%a de reemplazo valvular en el $ospital de Dipreca ( en el Instituto Nacional del 7ra8 en 5antia%o' El %rupo consisti en 23 mu1eres ( 6 $om*res con promedio de edad de 66 aos ran%o9 :0#.; aos' 7odos cumplan criterios clnicos ( de CRC previamente descritos inclu(endo la presencia de enfermedad mitral o mitro#artica con calcificaciones valvulares fusin comisural o am*os' Como muestras control se estudiaron las vlvulas de < pacientes no reumticos =: mu1eres ( tres $om*res con promedio de edad ;< aos> ran%o ?2#<<@ sometidos a ciru%a por estenosis calcica o valvulopata con%+nita' Nin%uno de ellos tena antecedentes de ER&'

4rocedimiento
Extraccin de ADN Cada muestra de te1ido valvular se dis%re% ( transfiri a 2 mi de buffer de di%estin con 3 6 m%Aml de proteinasa B para incu*acin durante 2< $ a <3CC' Lue%o de centrifu%ar las muestras a 033 8 % por < min se aadi al so*renadante 2 mi de DN&zol rea%ent para volver a centrifu%ar a 23'333 8 % durante 23 min' El &DN se precipit con etanol al 233D ( se incu* por : min centrifu%ndose lue%o a ;'333 8 % por ? min' Este procedimiento se repiti ? veces con etanol al .6D' Finalmente el &DN se solu*iliz en a%ua ultrapura ( las muestras se almacenaron a #;6CC $asta su anlisis' Amplificacin por PCR.(Reaccion de Polimerasa en cadena) 4ara la amplificacin del &DN se emplearon partidores universales para la re%in 2<5 r&RN cu(a secuencia especfica es9 2<5 r&RN F#6E-&- -&& --7 --- -&7 -&C -7:E ( 2<5 r&RN R# 6E&-- CCC --- &&C -7& 77C &C:' Esta mezcla se incu* en presencia de &DNsaI =Invitro%en@ durante <3 min a :.CC ( :3 min a 03CC' Este procedimiento se realiz para minimizar el ries%o de contaminacin de los reactivos' La reaccin de amplificacin se realiz en un termociclador 4erFin Elmer -ene&mp 4CR 5(stem ?;33'

 Control de la tcnica de PCR. La amplificacin de un fra%mento del %en para la $ormona de crecimiento =)C@ se utiliz como control de la eficiencia de la reaccin de 4CR' Como control positivo *acteriano se us &DN de una cepa de E"-& {Streptococcus pyogenes). &dicionalmente en cada e8perimento se inclu(eron muestras G*lancoH con todos los reactivos de la reaccin de 4CR e8ceptuando el &DN del te1ido valvular'

Deteccin del producto de PCR. Los productos de 4CR se separaron por electroforesis durante 03 min a 233 Iolts en %el de a%arosa al ? 3D ( se tieron con *romuro de etidio =3 36 Li%Aml@' Los resultados se analizaron con el software BodaF Electrop$oresis Documentation and &nal(sis 5(stem 2?3'

Resultados

La 7a*la 2 resume las caractersticas clnicas de los pacientes con CRC e indica !u+ vlvulas se investi%aron ( en cules se detect positividad para &DN *acteriano en la reaccin de 4CR' Como puede verse se detect &DN *acteriano en 2? de las 26 muestras de valvulopata reumtica investi%adas =/3D@' Las Fi%uras 2#&' 5e inclu(en los controles positivos para &DN *acteriano ( los *lancos en cada caso' La ne%atividad de los *lancos es imprescindi*le para descartar contaminaciones con &DN *acteriano de*ido a la alta sensi*ilidad de esta t+cnica' Las F i%uras 2#" ( ?#" ilustran el control interno de la reaccin de 4CR con $ormona de crecimiento'