ISOELECTROENFOQUE

EQUIPO 3 COQUIMATLN,COL; 12 DE FEBRERO DE 2014

Introduccin

Una protena tiene grupos cargados de ambas polaridades, por lo que presenta un punto isoelctrico (pI) que corresponde al valor de pH al cul la molcula posee carga neta (z) igual a cero (zwitterion), y por lo tanto es inmvil en un campo elctrico.

Isoelctroenfoque
FUNDAMENTO

se basa en el desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Esta tcnica separa protenas de acuerdo a sus puntos isoelctricos.

Procedimiento

Se establece un gradiente de pH el gel de poliacrilamida. Se adiciona una mezcla de cidos y bases orgnicos de baja masa molecular (anfolitos); se deja que se distribuyan en el campo elctrico generado a travs del gel. El gel suele tener urea, de concentracin cercana a 6M, no posee carga y no puede afectar en forma directa la carga neta de las protenas Las molculas anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH.

La regin del nodo es cida y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del rango.

Se coloca una mezcla de protenas en un pocillo de gel. Con la aplicacin de un campo elctrico, las protenas entran el gel y se desplazan hasta alcanzar un pH equivalente a su pI.

Al aplicar la diferencia de potencial las protenas que se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoelctrico estarn cargadas positivamente, y migraran hacia el ctodo; mientras que aquellas que se encuentran en regiones de pH ms altos que su punto isoelctrico tendrn carga negativa y migrarn hacia el nodo.

Electroforesis bidimensional
Una vez enfocadas las protenas de acuerdo a su pI, se separan por tamao en un gel de SDS-PAGE.

La electroforesis bidimensional separa protenas con valores de PI similares pero con diferentes masas moleculares.

Se tien los geles se adquieren las imgenes de los geles con un escner de alta resolucin se analizan con un software especializado. As se pueden comparar geles y observar cambios en el patrn de manchas:

Ventajas

Un anfolito siempre se detiene en la zona en la que el pH coincide con su punto isoelctrico. til como herramienta analtica y preparativa.

Gran repetitividad: los resultados no estn sujetos a variaciones debidas a las condiciones experimentales, tales como la diferencia de potencial elctrico aplicada.
Gran poder de resolucin. La muestra se puede colocar en cualquier zona del medio de soporte, en la zona cercana al ctodo, al nodo o en el centro del mismo.

Bibliografa

http://ufq.unq.edu.ar/DocenciaVirtual/BQblog/Electroforesis%202D%20(IEF+SDSPAGE).pdf

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencia s/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.ht ml Lehninger, principios de Bioquimica 5 edicion pag. 90

Stryer, L., Berg, J.M., Tymoczko, J.L. (2008). (6 edicin). Bioqumica. Ed.: Revert. Pag 73