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Uma investigao sobre novos hidrazona complexos de rutnio(II) como agentes anticncer e sua interao com biomolculas

Aluna: Ana Paula Segantin Gaspari

Ribeiro Preto/2014

INTRODUO
Desenvolvimento de metalo-frmacos

Desenvolvimento de frmacos que interajam com stios especficos


Cisplatina: busca por frmacos que possam ser utilizados em tratamentos de tumores resistentes a ela. DNA: intercalao com complexos distorce helicoidal (inibio da replicao de enzimas) forma

Variao de ligantes: diferentes interaes com o DNA.

MTODOS
Sntese e caracterizao dos complexos Estudo da ligao dos complexos ao DNA (timo de bezerro) CT-DNA
- Espectros de absoro do CT-DNA na ausncia e presena dos complexos em tampo tris-HCl (pH = 7,2). - Estudos de luminescncia na presena de brometo de etdeo: competio pela interao com o DNA.

MTODOS
Estudo da interao dos complexos a uma protena (albumina de soro bovino). Por que albumina? Abundncia no sangue Interao com frmacos Transporte de ons metlicos, complexos pela corrente sangunea Ligao reversvel endgenos e exgenos Mudanas no espectro de emisso do triptofano mudana de conformao.

MTODOS
Ligao dos complexos a protena (albumina de soro bovino)

- Anlise da intensidade de emisso de resduos de triptofano (excitao em 280 nm e emisso em 345 nm) ao adicionar os complexos em tampo fosfato. Estudos de citotoxicidade
-Teste MTT em clulas HeLa (cncer cervival humano) e clulas sadias NIH3T3 (fibroblasto embrionrio de rato)

RESULTADOS E DISCUSSO

Snteses

MeOH [Ru(H)(Cl)(CO)(PPh3)3] + Refluxo por 12h

MeOH cis-[RuCl2(DMSO)4] + Refluxo por 12h

Espectroscopia Uv-vis com adio de quantidades crescentes de DNA (titulao)


Adio do CT-DNA solues dos complexos fazendo-se fatores de correo para no terem erros devido diluio. Duas Hipteses: - Deslocamento para a regio IV (batocrmico) e diminuio das bandas (hipocrmico) Interao via intercalao

- Deslocamento da a regio UV (hipsocrmico) e aumento das bandas (hipercrmico) Interao eletrosttica


Wang, H.F., Shen, R. e Tang, N. European Journal of Medicinal Chemistry, 44 (2009) 4509-4515

Espectroscopia Uv-vis com adio de quantidades crescentes de DNA


Ligante (Ci = 25 M) Complexo 1 (Ci = 25 M) Complexo 2 (Ci = 25 M)

Absorbncia

Absorbncia

Absorbncia

*CT-DNA variando de 0 a 40 M - Diminuio das bandas e pequeno desvio para IV (2 nm) com adio de CT-DNA: intercalao.

Clculos das constantes de ligao intrnseca


Kb = 1,4 x104 L mol-1 (HL) Kb = 4,11 x 104 L mol-1 (Complexo 1) Kb = 9,90 x104 L mol-1 (Complexo 2)
AFINIDADE Complexos > Ligante livre Complexo 2 > Complexo 1

Complexo 2 > Kb devido ao maior efeito hidrofbico de complexos que contm DMSO. Ligantes: tamanho e forma interferem na fora da ligao com o DNA.

Ensaios de Fluorescncia: confirmao da interao por via intercalativa - brometo de etdeo (BE)

- BE forma complexos com cidos nuclicos e possuem intensa fluorescncia na presena de DNA, devido intercalao. - Verificao da supresso da fluorescncia: competio pelo stio de ligao. Confirmao da interao via intercalao.

Ensaios de Fluorescncia: confirmao da interao por via intercalativa - brometo de etdeo (BE)
Complexo 1 Complexo 2

ligante
Intensidade de emisso

Intensidade de emisso

[BE] = 7,5 M / [DNA] = 7,5 M / [COMPLEXOS] = 0 16 M

Clculo da constante de Stern-Volmer para obteno de Kq (quenching constant)

Intensidade de emisso

Clculos das constantes de supresso


Kq = 1,73 x102 L mol-1 (HL) Kq = 1,55 x 103 L mol-1 (Complexo 1) Kq = 8,26 x105 L mol-1 (Complexo 2)
Comprovao AFINIDADE Complexos > Ligante livre Complexo 2 > Complexo 1

Supresso da fluorescncia do BE ocorre devido competio pela intercalao com o DNA

Estudo da Interao dos complexos com a albumina


Complexo 1 Complexo 2 Ligante

Intensidade de emisso

Intensidade de emisso

Condies: Albumina: 1 M, ex = 280 nm e em = 345 nm. Ligante, Complexo 1 e 2 = 0-12 M

Aumento da concentrao do ligante, complexo 1 e 2 Supresso

Intensidade de emisso

Clculos das constantes de supresso


Kb = 4,4 x103 L mol-1 (HL) Kb = 2,02 x104 L mol-1 (Complexo 1) Kb = 3,40 x 105 L mol-1 (Complexo 2)
AFINIDADE Complexos > Ligante livre Complexo 2 > Complexo 1

Complexo 2 > Kb devido ao maior efeito hidrofbico de complexos que contm DMSO, maior interao com a protena.

Citotoxicidade
Testes MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) determinao colorimtrica de viabilidade celular.

Somente clulas vivas reduzem o reagente amarelo (MTT) ao produto azul (formazan).
IC50 = concentrao requerida do complexo para levar 50% das clulas morte.

Citotoxicidade

Concluso
Complexo 2 apresenta uma maior afinidade pelo DNA e pela albumina, e tambm apresenta melhores resultados de citotoxicidade. Ambos os complexos so ativos contra clulas cancergenas, mas no so ativos contra linhagens sadias.

Obrigada =)