Caracterizao trmica e estrutural da Hemoglobina extracelular gigante do Rhinodrilus alatus (HbRa).

Aluno: Thiago Moreira

Estrutura e funo de hemoprotenas

As protenas so biopolmeros compostos basicamente por carbono, hidrognio, nitrognio, oxignio, enxofre, e algumas protenas podem possuir tomos de metal em sua estrutura, e essas molculas desenvolvem diversas funes no meio biolgico, como funo enzimtica, revestimento, defesa, transporte entre outras [1]. Uma das classes de protenas muito estudadas so as hemoprotenas, que so protenas globulares, que possuem em sua estrutura grupo prosttico (tomo de Ferro) ligado a quatro tomos de nitrognio do anel protoporfirinico.

 As globinas constituem um dos sistemas mais importantes dentro da qumica das protenas. As propriedades intrnsecas das hemoprotenas, assim como a sua relao estrutura-atividade, envolvem fenmenos tais como cooperatividade e afinidade seletiva por ligantes especficos que esto associados a uma variedade de mecanismos que tornam possvel a vida [1,4,6].

A hemoglobina humana uma das hemoprotenas mais estudadas, e teve sua estrutura resolvida utilizando a tcnica de cristalografia de raios-X. Esse trabalho foi realizado por Max Perutz em 1959, que revelou uma protena esfrica, com dimenses em torno de 6,5 x 5,5 x 5 nm3 e massa molecular em torno de 64 kDa.

 Figura 1: Estrutura de duas hemoprotenas bastante estudadas (A) hemoglobina cuja principal funo o transporte de oxignio dos pulmes para as clulas, (B) mioglobina que possui a funo de armazenar o oxignio nas clulas [3].

Grupamento Heme
O grupo heme consiste de quatro anis pirrlicos coplanares, ligados entre si, e com um tomo de ferro central, que se encontra 0,3 fora do plano da porfirina coordenado aos tomos de nitrognios do anel da porfirina, como mostra a ilustrao da Figura 2 [1,5].

Figura 2: Grupo prosttico heme que constitudo de uma protoporfirina e um tomo de ferro central [3].

 O grupo heme encontra-se inteiramente no interior da estrutura com exceo da extremidade que contm dois grupos polares propionatos, que direcionam-se para fora, e encontram-se envolvidos por molculas de gua [1,3]. A vizinhana do grupo heme composta por aminocidos apolares com exceo de duas histidinas, a distal e a proximal que se encontram nas hlices H e F, respectivamente, Figura 3B, [3,5].

Figura 3: (A) Grupo heme na forma T tensa desoxihemoglobina esquerda e na forma R relaxada oxi-hemoglobina direita. (B) Grupo heme, mostrando as seis coordenaes do Ferro. Em amarelo aparece a molcula de oxignio coordenada, em vermelho o grupo pofirnico, em cinza na parte inferior a Histidina proximal (F8 significa que a histidina o resduo de nmero oito da hlice-F) [3].

Hemoglobinas gigantes extracelulares

As hemoglobinas dos invertebrados apresentam similaridade com a dos vertebrados, no entanto, as suas subunidades se arranjam de maneira diferente. Principalmente no caso dos aneldeos, que podem apresentar hemoglobinas extracelulares e, em alguns casos, intra e extracelulares [7]. As hemoglobinas extracelulares so tambm conhecidas como eritrocruorinas e so encontradas em espcies de aneldeos como a Lumbricus terrestris, Glossoscolex paulistus e Rhinodrilus alatus, sendo pertencentes classe oligochaeta. Uma das principais caractersticas destas hemoglobinas que elas possuem uma quantidade relativamente grande de subunidades com pesos moleculares entre 16 kDa a 19 kDa, conferindo protena uma massa molecular total em torno de 3,6 MDa. Alem disso, essas hemoglobinas apresentam uma alta cooperatividade na ligao de oxignio, o que as torna um sistema interessante do ponto de vista estrutural e de organizao das vrias subunidades, sendo um modelo interessante no estudo de relao entre sua estrutura e funo [8,9].

 Entre as hortolgas gigantes extracelulares, a mais estudada a do Lumbricus terrestris (HbLt) que serve como modelo de comparao com outras hemoglobinas homolgas, tal como, a hemoglobina de Glossoscolex paulistus . A estrutura cristalogrfica mais recente da HbLt reportada na literatura com resoluo de 3,5 mostra com bastante detalhe a disposio em bicamada hexagonal das vrias cadeias polipeptdicas que compem a protena, incluindo as cadeias globnicas e os linkers (Figura 4) [10].
Figura 4: Estrutura quaternria da hemoglobina ntegra de Lumbricus terrestris, que pertence mesma classe Oligochaeta que a hemoglobina de Glossoscolex paulistus, contendo 144 cadeias globnicas contendo o grupo heme e 36 cadeias Linkers em um arranjo espacial conhecido como modelo do bracelete [7]. O dodecmero composto por 3 tetrmeros (abcd)3, A estrutura do tetrmero corresponde 1/12 da molcula ntegra contm 1 dodecmero e 3 linkers L3 correspondendo a (abcd)3L3. (A) ntegra, (B) dodecmero,(C) Tetrmeros e (D) dmero [10].

HbGp
A hemoglobina do aneldeo Glossoscolex paulistus a (HbGp) apresenta uma massa molecular de 3,6 MDa, determinada por Carvalho e colaboradores [8] utilizando a tcnica de ultracentrifugao analtica atravs do coeficiente de sedimentao. Devido similaridade estrutural entre HbGp e HbLt pode-se propor que essa macroprotena apresenta uma disposio altamente organizada envolvendo 144 cadeias polipeptdicas que contm o grupo heme e 36 cadeias polipeptdicas sem grupos heme, que so denominadas cadeias Linkers (Figura 5) [10]. A estrutura oligomrica composta de dois discos hexagonais, que formam uma espcie de bicamada hexagonal sendo que a dissociao dessa estrutura d origem a doze unidades de massa molecular equivalente a 1/12 da molcula ntegra correspondendo a cerca de 300 KDa [10,11], e cuja estrutura (abcd)3L3, ou seja, contm um dodecmero, (abcd), e trs linkers, L3.

Rhinodrilus alatus Righi, 1971.

O minhocuu Rhinodrilus alatus Righi, 1971, da famlia Glossoscolecidae uma minhoca de grande porte, de 56 a 63 cm de comprimento por 11 a 12 mm de dimetro. uma espcie muito usada por pescadores como isca nos rios da bacia do So Francisco e no Pantanal Matogrossense. Foi descrita por Right em 1971 nas regies de Cerrado de Paraopeba e Sete Lagoas, em Minas Gerais. Entre abril e setembro, os indivduos entram em diapausa. Se abrigando em galerias, de 30 a 50 cm de profundidade e 8 cm de dimetro, revestindo-a de muco, abrigando em geral um minhocuu, raramente dois. Cada indivduo enrola-se e cobre-se com um muco espesso, o que reduz a perda de gua (MARIA; DRUMOND; LVARES, 2008).

HbRa
Title: Characterization of the subunits of the giant extracellular hemoglobin of Rhinodrilus alatus (HbRa) by MALDI-TOF-MS: evidence for strong interaction with cationic surfactants DTAB and CTAC Author(s): Tabak, M.; Carvalho, F. A. O.; Carvalho, J. W. P.; et al. Conference: 22nd IUBMB Congress/37th FEBS Congress Location: Seville, SPAIN Date:SEP 04-09, 2012 Sponsor(s): IUBMB; FEBS

Prof. Dr. MARCEL TABAK IQSC USP- So Carlos

Linhas de Pesquisa Hemoprotenas. Interao de frmacos com sistemas modelo biofsicos. Fsico-qumica de membranas modelos e naturais. Qumica de protenas. Espectroscopia de ressonncia magntica eletrnica e nuclear aplicada a sistemas biofsicos. Fluorescncia de frmacos e protenas. Dicroismo circular de hemoprotenas. Aplicao de Radiao Sincontron ao Estudo de sistemas biolgicos.

Objetivo Geral
Caracterizao trmica e estrutural da hemoglobina Extracelular gigante do Rhinodrilus alatus.

Objetivos Especificos
Caracterizar a HbRa por meio de Microcalorimetria diferencial de Varredura (DSC) Determinao da estrutura protica de HbRa por meio de cristalografia de difrao de raios X.

Materiais e Metodos
Extrao e purificao da HbRa pelo metodo de Extrao de HbGp. A HbGp obtida pela extrao do sangue do aneldeo Glossoscolex paulistus (Figura 7), atravs de um corte no dorso do animal aps o mesmo ser anestesiado em atmosfera de ter etlico. Ao sangue coletado adicionada soluo anticoagulante de citrato de sdio e cido ctrico 0,10 mol/L [30].

 Aps a coleta, o sangue extrado centrifugado por 15 min a 2500 rpm para remoo de possveis impurezas slidas. Em seguida ultracentrifugado por um perodo de 3 horas a 250.000 x g, a 4 oC. Aps o processo de ultracentrifugao a protena obtida na forma de pellet (hemoglobina sedimentada no fundo do tubo). O pellet foi ressuspendido em um volume mnimo de tampo TrisHCl 100 mmol/L pH 7,0. Como processo final de purificao a hemoglobina filtrada em coluna de gel de Sephadex G-200, obtendo-se a protena pura na forma oxi-HbGp. A concentrao da HbGp determinada por absoro ptica utilizando coeficiente de absortividade molar 415 nm = 5,5 L mol-1cm-1 na banda de Soret [30]

Preparao das amostras utilizadas nas medidas das diferentes tcnicas experimentais.
Microcalorimetria diferencial de varredura (DSC) Os experimentos sero realizados no Laboratrio do CETEC A preparao seguir o procedimento adotado para preparao de amostras de HbGp As amostras da hemoglobina extracelular de Glossoscolex paulistus (HbGp) nas formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp usadas nas medidas de DSC foram preparadas seguindo os seguintes procedimentos: solues proticas na concentrao de 0,5 mg/mL foram obtidas a partir de solues estoques de concentraes 5,0 e 6,0 mg/mL, respectivamente. Essas amostras foram preparadas no intervalo de pH 5,0 - 8,0 em soluo tampo 20 mmol/L de fosfato-acetato para valores de pH cidos e fosfato-borato em meio bsico. As amostras foram submetidas dilise por 4 horas com a troca do tampo no respectivo pH a cada hora, sendo usado o ltimo tampo da dilise como soluo de referncia para a linha de base. Todas as amostras foram deareadas por dois minutos sob agitao magntica com velocidade de rotao mdia.

 As medidas de DSC com a oxi-, meta- e cianometa-HbGp em pH 5,0 e 6,0 foram realizadas com razo de aquecimento 1 oC/min. No pH 7,0 e 8,0 foram usadas razes de aquecimento de 0,5, 0,75, 1,0 e 1,5 oC/min. Todas as medidas de DSC foram realizadas no intervalo de temperatura de 25 a 95 oC, presso constante de 2 atm e 15 minutos de estabilizao na temperatura inicial. Tambm foram realizadas medidas com dois ciclos de aquecimento para verificao da reversibilidade do processo de desnaturao da HbGp, sendo a amostra estabilizada em 30 oC por 15 minutos e aquecida at 90 oC com razo de aquecimento de 1 oC/min. Em seguida, a amostra foi resfriada at a temperatura inicial de 30oC, mantida nessa temperatura por mais 15 minutos antes de ser reaquecida at a temperatura final de 90 oC. Na realizao das medidas foi usado um aparelho microcalorimtrico modelo VP-DSC da Microcal com potencial de operao na faixa de temperatura de -10 a 110 C e presso de 2 atm com volume de clula de 0, 512 mL. Todos os experimentos foram realizados em triplicata, em dias diferentes e com amostras preparadas de diferentes estoques. Os dados obtidos foram analisados usando o software Origin verso 7.0Lab fornecido junto com aparelho pela Microcal. A subtrao do branco (tampo), correo da linha de base e clculo da rea do pico do termograma da HbGp foram realizadas sistematicamente nas anlises de dados

Espectroscopia UV/visvel (Absoro Optica)

Possivelmente as anlises sero realizadas no Laboratrio de anlises qumicas do CETEC/Redemat. As medidas de absoro ptica no UV-VIS com HbRa sero realizadas em duplicata utilizando uma concentrao de 0,3 mg/mL em soluo de tampo fosfato-acetato 20 mmol/L nos valores de pH cidos e de fosfatoborato nos valores de pH bsicos. As amostras foram preparadas no intervalo de pH de 5,0 a 9,0, sendo que todas as amostras tiveram seus valores de pH checados aps a preparao, usando um pH-metro. As amostras foram condicionadas numa cubeta de quartzo de caminho ptico 1 cm, com capacidade para 1 mL de soluo. Os espectros foram obtidos na faixa de comprimento de onda de 250-700 nm com a coleta de um ponto a cada 0,5 nm e velocidade de varredura mdia. Os dados de absoro ptica foram obtidos no intervalo de temperatura de 25 - 70 oC, sendo obtido um espectro a cada 5 oC. Os espectros foram obtidos aps a estabilizao da amostra em cada temperatura por cinco minutos. A temperatura da amostra foi monitorada por um termopar inserido diretamente na amostra.

Cristalografia por difraao de Raios-X.

Os experimentos sero realizados no Laboratrio LabCri-UFMG Para ser estudada atravs da difrao de raio-x, a protena precisa estar necessariamente cristalizada. Somente neste estado que a biomolcula apresenta uma estrutura ordenada passvel de ser trabalhada com a difrao. a etapa mais demorada, dispendiosa e de alta taxa de fracasso. A falta de sucesso causada pela baixa qualidade das protenas. Portanto, de extrema importncia realizar experimentos paralelos a esta etapa a fim de certificar-se e avaliar a qualidade do material a ser cristalizado. A cristalizao pode ser realizada em condies de microgravidade. Microgravidade quando a fora gravitacional tem efeito anulado ou atenuado, como no espao ou em rbita do planeta. Sob tais situaes as protenas cristalizaro de maneira mais uniforme e ordenada, formando cristais maiores e mais regulares. O processo inteiramente automatizado, possuindo uma 2 gerao de robs desenvolvida capazes de executar inmeros experimentos simultaneamente, monitorar o processo, inserir os reagentes necessrios e selecionar cristais[2].

 O mtodo mais comum de cristalizao de protena a Difuso de Vapor. Possuindo duas variantes neste mtodo, a hanging drop e sitting drop, o processo consiste em uma pequena quantidade de soluo (gota) contendo concentraes equivalentes de protenas e reagentes precipitantes e uma soluo reservatrio com as mesmas substncias em concentraes dobradas em um sistema isolado. Devido a diferena de concentrao a gua da gota lentamente evaporar para a soluo reservatrio. Assim pode-se, ento, iniciar a cristalizao das protenas na gota[11].

Tcnicas
Microcalorimetria diferencial de varredura (DSC) A Microcalorimetria diferencial de varredura (DSC) uma tcnica usada amplamente no monitoramento das variaes de energia envolvidas nos processos de desnaturao de macromolculas biolgicas. O aparelho microcalorimtrico constitudo por um sistema adiabtico mantido presso constante, onde duas clulas idnticas revestidas por jaquetas adiabticas so mantidas na mesma temperatura, uma para a amostra e outra para o padro ou referncia. O calor fornecido ao sistema de forma controlada [39]. A medida da variao de energia no sistema consiste na comparao dos calores absorvidos ou liberados pelas duas clulas durante o ciclo de aquecimento. A diferena de energia absorvida ou liberada expressa em grfico de capacidade calorfica (Cp) em funo do aumento de temperatura. Essa tcnica bastante sensvel na deteco de variao de energia no processo de desnaturaode macromolculas, requerendo uma quantidade mnima de matria da ordem de 10-4 mol/L [34]. A diferena de calor liberado ou absorvido no ciclo de aquecimento corresponde diretamente ao calor absorvido ou liberado pelas molculas presentes na amostra em estudo [42-44].

 Dos resultados das medidas microcalorimtricas so extrados vrios parmetros termodinmicos, tais como a variao da capacidade calorfica Cp, a variao de entalpia (H), a variao de entropia (S), a temperatura de transio (Tm) e a variao de energia livre (G). Todos esses parmetros termodinmicos so dependentes da natureza do processo de desnaturao da protena [39-42]. A variao da entalpia e entropia em funo da temperatura no sistema determinada atravs da capacidade calorfica a presso constante Cp que medida diretamente por DSC.

Cristalografia por difraao de Raios-X.

Uma fonte de raio-X emitira radiao que atravessar a amostra de protenas cristalizadas e sofrer difrao. Um anteparo posicionado em volta da amostra de cristais captar os raios desviados de sua trajetria. Ento, medindo o ngulo de difrao do raios e conhecendo o comprimento de onda, poder-se- esboar o posicionamento dos tomos que compem a cadeia de aminocidos. necessrio um alinhamento manual entre amostra e equipamento. Porm, desenvolvido um novo mtodo automatizado, que produzir o mesmo efeito e mesma preciso usando um sistema de raio-x convencional. A radiao pode esquentar e danificar a amostra de protenas. Para evitar tais danos, pode-se resfriar os cristais.

Resultados Esperados
Espera-se que a estrutura de HbRa determinada apresente uma semelhana com as Estruturas de HbGp e HbLt. Quanto a caracterizao trmica espera-se determinar o processo de desnaturao e conhecer e avaliar a estabilidade termo- dinmica de HbRa.

Cronograma
Junho Julho Agosto Setembr o
Outubro Novembro Dezembro Janeiro Fevereiro

REVISO DA LITERATURA

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X

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X X

OBTENO HBRA

DSC

X X X X

DR-X

DISSERTAO

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REVISO DO CONTEDO