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SESIN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plsmido para que adquieran resistencia a un antibitico
SESIN 3: FUNCIN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIN Cortar el plsmido aislado con enzimas de restriccin y visualizarlo en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio
Escherichia coli
Medio LB + KANAMICINA
Origen de replicacin
PURIFICACIN PLSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA
La diferencia en TAMAO entre el DNA cromosomal y el DNA plasmdico permite desarrrollar estrategias de purificacin
Plsmidos
TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento
TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento
TOPOISMEROS DE PLSMIDOS:
diferentes formas de enrollamiento
PURIFICACIN PLSMIDOS
Niveles de impurezas aceptados por la FDA
Purificacin de plsmidos
1. Lisis
Qumica Mecnica Cambios en la Tempratura
Precipitacin fraccionada Adsorcin a membranas Mtodos cromatogrficos: Intercambio inico Filtracin en gel Afinidad
Glucosa
Solucin de lisis
Solucin de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1% Esta solucin disuelve los fosfolpidos y los componentes protecos de las membranas celulares. SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CLULAS
El NaOH desnaturaliza el DNA plasmdico y cromosomal
Lavar el botn con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de SDS. Tambin remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se evapora ms rpido
Purificacin de plsmidos
1 Precipitacin con isopropanol 2 Cromatografa intercambo aninico 3 Filtracin con membrana de nitrocelulosa 4 Lo que se retuvo en la membrana de nitrocelulosa
DNA cromosomal
Uso de colorantes