V Seminario Nacional de Plantas Medicinales, Aromticas y Floricultura Tropical

Ponencia
Productos derivados de plantas: Una aproximacin a la bsqueda racional del efecto antimicrobiano.

Romn Yesid Ramrez R MsC Microbiologa Docente Investigador. UPTC

Ideas centrales

Productividad Cientfica en el rea

Bsqueda racional de efecto antimic de platas

Tcnicas para probar el efecto antimicrobiano

En Colombia existen alrededor de 50.000 especies vegetales conocidas, solo aproximadamente 5.000 de ellas han sido usadas con propsitos mdicos

Evaluacin de la productividad
Antibact 25.000+

Antiparasit 2.700+

Science Direct
5 aos

Antifngico 5.000+

Antiviral 17.000+

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

RECOLECCION
Segn el estudio propsito del

Tamizaje rea geogrfica Plantas conocidas Usos tradicionales *Identificacin taxonmica de la planta

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

RECOLECCION
Reglas generales de recoleccin
Corteza recogida con una atmosfera de humedad (facilitar su separacin) cortando segmentos de forma vertical para que contine el transporte de savia Races, tubrculos y bulbos preferiblemente durante el invierno, en el periodo de reposo vegetativo, contenido de los principios activos alcanza su mximo Herbceas y las hojas cuando se inicia la floracin, durante los periodos secos, esto permite a la planta regenerarse en el periodo de lluvias.

RECOLECCION

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Reglas generales de recoleccin

Flores deben ser cortadas antes de que abran completamente. Las frutas se recolectaran antes de alcanzar su estado maduro Las semillas se recolectarn cuando los frutos estn maduros
Sharapin, Fundamentos de tecnologa de productos fitoterapeticos

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

SECADO
Objetivos

Interrupcin de los procesos de degradacin causados por enzimas y fermentos Impide el desarrollo de microorganismos Impide reacciones de oxidacin e hidrlisis No ms de 40C Cantidad de agua << al rendimiento de producto

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

EXTRACCIN
Extractos y aceites vegetales (Subproductos mas frecuentes para investigacin de efecto antimicrobiano) Aceites esenciales Hidrodestilacin Enfleurage o enfloracin Extraccin con grasa caliente Extraccin con solventes Fludos supercrticos

Extractos secos de plantas

Extraccin slido lquido Solventes

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana

Efecto Antibact

Efecto Antiparasit

Efecto Antimicro

Efecto Antifngico

Efecto Antiviral

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Pruebas de susceptibilidad antibacteriana

Mtodos evaluacin del efecto antimicrobiano

Tcnicas microbiolgicas

Met. de disco impregnado Met. del agujero en el agar Mt. del cilindro

Difusin en agar

Dilucin en agar

Dilucin en caldo Dilucin en agar

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Mtodos de difusin en agar

Mtodo del disco impregnado Creado por Bauer y cols en 1966 Estandarizado por OMS en 1977 Sujeta a modificaciones por CLSI Discos de papel de filtro de 6 mm de dimetro como reservorio Agar Mueller Hinton Inculo bacteriano: MacFarland 0,5 (Incubacin: 35C/24 h Reporte: Halo de inhibicin en mm No se puede establecer directamente la CMI Problemas de difusin de compuestos apolares

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Mtodo del agujero en el agar

Estandarizado por U.S Pharmacopeial Convention en 1975 Reservorio: Agujero de 12 mm 200 L del antibitico o extracto Agar Mueller Hinton Inculo bacteriano: MacFarland 0,5 Reporte: Halo de inhibicin en mm No se puede establecer directamente la CMI Poco preciso (profundidad de la capa de agar, etc)

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Mtodo del cilindro

Estandarizado por U.S Pharmacopeial Convention en 1975 Reservorio: cilindro hueco de porcelana o acero inoxidable 100 L del antibitico o extracto Agar Mueller Hinton Inculo bacteriano: MacFarland 0,5 Reporte: Halo de inhibicin en mm No se puede establecer directamente la CMI Poco preciso (inestabilidad de los cilindros)

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Mtodos de dilucin Mtodos de Dilucin Dilucin en caldo Dilucin en agar

Macrodilucin

Microdilucin
Normalizados por el documento M07-A9 del CLSI

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Dilucin en caldo
Macrodilucin o dilucin en tubo 1 mL caldo MH + extracto 1 mL del inculo bacteriano (5 105 UFC/mL). Diluciones seriadas del extracto Incubacin: 35C/24 h Reporte CMB y CMI CMI Detencin del crecimiento bacteriano CMB Muerte de 99.9% del inculo inicial

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Dilucin en caldo
Microdilucin o dilucin en placa

100 l de caldo MH 100 l del extracto solubilizado 10 L del inculo bacteriano Diluciones empezar en 1 mg/ml Incubacin: 35C/24 h Sembrar controles (CC, CI, CE) Reporte CMB y CMI CMI Detencin del crecimiento bacteriano (no botn) CMB Muerte de 99.9% del inculo inicial

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Dilucin en caldo
Microdilucin o dilucin en placa (Lectura)
Lectura Visual CMI No botn o menor que el del CC Lectura indicadores Redox
INT (2 mg/ml)/10 l
TTC (20 mg/ml)/10 l MTT (0.5 mg/ml)/10 l

Incubar 30 min 2 horas

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Dilucin en Agar
La sustancia a probar es disuelta con el agar MH (una dil por caja) 1 L del inculo bacteriano Suspensin bacteriana: 104 UFC/mL Incubacin: 35C/24 h Sembrar controles (CC, CI, CE) Reporte CMI Ventaja: Probar varias bact en una sola caja Ni hay problemas de difusin Desventaja: 1 dil del extracto por cada caja

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Efecto Antimictico

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Efecto Antimictico
Evaluacin en levaduras

Normalizado por el documento M27-A3 del CLSI

Dilucin en caldo
Macrodilucin Microdilucin

RPMI 1640 con glutamina y sin bicarbonato sdico, tamponado a pH 7 y con 0,2% de glucosa Incubacin: 35 C Candida sp: 48 h C. neoformans: 72 h

1 mL

200 L

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Evaluacin en levaduras

Normalizado por el documento M44-A del CLSI

Difusin en disco
Uso de discos impregnados con el extracto MH con 2% de glucosa y 0,5 g /ml de azul de metileno Inculo: 0,5 de la escala de McFarland

Incubacin: 35 C 24 h para Candida spp 48 h para Cryptococcus spp

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Efecto Antimictico
Evaluacin en hongos filamentosos

Normalizado por el documento M38-A del CLSI

Dilucin en caldo Macrodilucin Microdilucin

RPMI 1640 con glutamina y sin bicarbonato sdico, tamponado a pH 7 y con 0,2% de glucosa
Incubacin: 35 C Rhizopus sp: 21-26 h Aspergillus, Fusarium y S. schenckii entre 46-50 h

1 mL

200 L

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Efecto Antiviral
Susceptibilidad a antivirales Fenotpicos
Ensayo de reduccin de placas Ensayo de absorcin de colorante

Algunas pruebas estn estandarizadas por la OMS (virus pandmicos)

Genotpicos
Mtodo de hibridacin de ADN Mtodo por PCR en tiempo real

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Efecto Antiviral
Mtodos Fenotpicos
Ensayo de reduccin de placas (ERP)
Inhibicin de la formacin de focos de ECP Cultivo celular (depende del virus) UFP/mL # de placas Vs [ ] del extracto CI50 Gold standard

Ensayo de absorcin de colorante (Dye uptake)

Capacidad que poseen algunas clulas viables para captar el rojo neutro y liberarlo en la presencia de un buffer de alcohol cido Medicin de la reduccin de la muerte celular Vs control sin antiviral Medicin de la absorbancia a 540 nm

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Efecto Antiviral
Mtodos Genotpicos
Mtodo de hibridacin de ADN
Hibridacin de las ssDNA que se liberan despus de la lisis celular de los cultivos infectados. Las sondas usadas son marcadas con I125 La radiacin cuantificada ser a la cantidad de virus que sobreviva a la accin del antiviral.

Medicin de carga viral despus de la exposicin a un antiviral o extracto

Mtodo por PCR en tiempo real

Amplificacin del ADN viral que queda en un cultivo celular despus de la exposicin a un virus. Primers y una sonda fluorescente dirigida a un gen especfico para el virus. CI50: [ ] del antiviral o extracto que reduce las copias de DNA viral en un 50% con respecto al control sin antiviral

Flujo de trabajo recomendado en la bsqueda del efecto antimicrobiano de plantas

Efecto Antiparasitario
Mtodos Tradicionales
La sustancia a probar se coloca directamente en el cultivo donde estn creciendo los parsitos . Efecto medible por reacciones Redox

Estandarizados por grupos de investigacin independientes

Modernos
Combina el sistema de siembra de los parsitos con la biologa molecular

Conclusiones Gran desarrollo en la bsqueda del efecto antimicrobiano de derivados de plantas Aplicar el mtodo cientfico y las especificaciones propias del rea de estudio Empezar por screenings y luego fraccionar Aplicar la estadstica para validar los resultados Pasar de la fase in vitro a la fase in vivo Y finalmente perseverar