CITOQUIMICA

APLICADA A LA HEMATOLOGIA

Bqca. Ivan Mara Victoria

Hematologa Clnica 2011

La citoqumica estudia la composicin qumica de la clula y permite detectar la localizacin topogrfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias.
MORFOLOGA <----->BIOQUMICA
Son un complemento de las tinciones hematolgicas. Por medio de ellas se localizan enzimas y sustancias inorgnicas. As se mejora la diferenciacin celular. Tambin sirven para el diagnstico de ciertas leucemias.

CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL Dx DE LAS LEUCEMIAS AGUDAS 70-80%

CITOMORFOLOGIA.

CITOQUIMICA.

90-95%

INMUNOFENOTIPO MAS MICROSC. ELECTRN.

99100%

CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR

Tres pasos fundamentales:

Fijacin: preservar las estructuras y reactividad

funcional de las clulas.

Incubacin en el medio de reaccin: como

consecuencia se generan productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.

Contraste: permite detectar con mayor facilidad el

producto de reaccin . Las reacciones deben tener 3 caractersticas: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad.

MUESTRAS UTILIZADAS

EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA

PUNCION DE MDULA SEA

PUNCION DE GANGLIOS LCR

TIPOS DE TINCIONES
Se pueden clasificar en:

Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que se pretende colorear, se pueden dividir en vitales y no vitales. Atendiendo al momento en el que empezaron a ser utilizadas para el Dx hematolgico, se dividen en tradicionales y especiales.

TINCIONES VITALES Y NO VITALES

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre clulas que estn vivas. Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin de un organismo vivo. Son colorantes vitales: el verde Jano y el azul de metileno. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismo del que proceden. Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada su estructura y el adherirlas firmemente a la superficie del portaobjetos.

TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES

Colorantes cidos: tienen una especial afinidad por las estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina (eosina). Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos (azul de metileno). Colorantes neutros: son sales de un cido y de una base coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro (eosinato de azul de metileno). Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad por estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias que tienen un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante (Sudn III)

Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones polcromas.

Una coloracin es panptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias colorantes neutras. Y es pancrmica cuando se aplican todas las sustancias colorantes neutras juntas.

Las reacciones citoqumicas pueden tambin clasificarse segn el mecanismo qumico involucrado

1-Progresivas estables: Son reacciones que exigen un tiempo mnimo pero no un mximo. 2-Progresivas indefinidas: En estas la reaccin contina y puede hacer ilegible el preparado o conducir a valores errneos. 3-Fugaces: Son las que pierden color rpidamente y no pueden conservarse mucho tiempo.

CLASIFICACION DE LAS TCNICAS CITOQUMICAS

CITOQUMICA CLSICA

CITOQUMICA ELCTRNICA

CITOQUMICA FLUORESCENTE

INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE

CITOQUMICA AUTOMATIZADA

Citoqumica Clsica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse e interpretarse con el
microscopio ptico comn.

Citoqumica electrnica: Se caracteriza por ser una metodologa de elevada sensibilidad Citoqumica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoqumica, se fijan sobre distintas estructuras de las
clulas y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores.

Inmunocitoqumica no fluorescente:Se basa en la marcacin de anticuerpos con sustancias que son

capaces de dar reacciones citoqumicas intensamente coloreadas que permiten su revelacin.

Fisicocitoqumca electrofortica Permite reconocer determinados componentes de las organelas

celulares obtenidas en solucin mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un campo elctrico y la identificacin por reacciones citoqumicas, permite identificar complejos isoenzimticos, mientras que los mtodos citoqumicos simples revelan una enzima en bloque.

Citoqumica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoqumica fluorescente

CITOQUIMICA ELECTRONICA:

CITOQUIMICA FLUORESCENTE:

INMUNES

NO INMUNES

INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE

CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:

CONSIDERACIONES PRACTICAS

Conservacin de la muestra Condiciones de la reaccin Observacin la microscopio Interpretacin

(ausencia/presencia/,morfologa/distribucion)

(FAL)

(score o ausencia/presencia)

Estandarizacin
Reactivos utilizados

Pueden ser reconocibles.

SUSTANCIAS RECONOCIBLES: 1-DNA Y RNA. 2-PROTEINAS. 3-HEMOGLOBINA. 4-HIDRATOS DE CARBONO. 5-LIPIDOS. 6-FOSFOLIPIDOS. 7-METALES ENZIMAS RECONOCIBLES 1-MIELOPEROXIDASAS (MPO) 2-FOSFATASA ALCALINA (FAL) 3-FOSFATASA ACIDA (FAC) 4-ESTERASAS (EST) 5-FOSFATASA ACIDA TARTRATO RESISTENTE (FAC-TR) 6-DEHIDROGENASAS (DH)

CITOQUIMICA CLASICA
Reconocimiento de principios no enzimticos:

Hidratos de carbonos: PAS

Fe hemosidernico: PERLS
Lpidos: Red Ol/Sudan Black Hemoglobina fetal: elucin acida

Reconocimientos por principios enzimticos:

MPO FAL FAC

ESTERASAS
CATALASAS

ENZIMAS HIDROLITICAS

TINCIONES CLASICAS:

1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS

TINCIN DE PAS (Peryodic Schiff Acid)

Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en los carbohidratos por la accin del cido perydico, potente agente oxidante, liberndose grupos aldehdo que al combinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de color rojo prpura intenso.

-C-C-

ALDEHIDOS

PURPURA

ACIDO PERYODICO

SCHIFF

Progenie linfoide normales (-)

Hasta llegar al linfocito donde un 30% es (+) en corona de grnulos Positividad en mazacotes Serie roja anormal (+) [LMA6]

Linfoblastos leucmicos (+) Serie roja normal (-) Serie granulocitica (+) difusa

PAS en neutrofilos con un patrn difuso

LMA6 (eritroide) MO PAS: todos los precursores eritroide contienen glucgeno, nunca los normales.

Reaccin de PAS, mdula sea. Grnulos gruesos en el citoplasma de los linfoblastos.

TINCION DE PERLS

Los grnulos de hemosiderina detectables citoqumicamente mediante la reaccin de Perls.

Se basa en la liberacin de los iones frricos de su unin con las protenas por la accin del cido clorhdrico; dichos iones frricos al reaccionar con el ferrocianuro potsico dan un precipitado azul verdoso de ferrocianuro frrico.
Por esta reaccin se detecta el Fe hemosidernico, que es insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina que es hidrosoluble.

Sideroblastos en anillo
Reflejando una anormalidad en la acumulacion de Fe en las mitocondrias (azul de prusia)

HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN

n de sideroblastos, tipo de los mismos y Fe macrofgico.

Bsicamente se presentas 3 patrones:

En el estudio del Fe medular hay que valorar conjuntamente 3 parmetros:

1) n sideroblastos alto y Fe de depsito aumentado: es frecuente hallarlo en estados anmicos que cursan con sobrecarga frrica.
2) n sideroblastos bajo y Fe de depsito disminuido o ausente: es el patrn caracterstico de la anemia ferropnica pura; de aparicin muy precoz en un balance frrico negativo. 3) n sideroblastos bajo con acmulo de Fe en los macrfagos medulares. Este patrn disociado es propio de entidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de los macrfagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a los eritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.

Hemocromatosis (cortes histolgicos de hgado)

HEMOGLOBINA FETAL Test de Kleihauer-Betke

La hemoglobina fetal (HbF o 22) es cido y lcali resistente. Por consiguiente, sometiendo un preparado fresco de sangre a una elucin cida ser arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloracin de estos ltimos. Los hemates con hemoglobina fetal se colorean con eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacas y aparecen como sombras.

Esta prueba se usa para determinar si hay GR del feto en una mujer embarazada con un grupo sanguneo Rh(-).

SUDAN BLACK / RED OIL

Ambas se utilizan para la deteccin de lpidos, en el caso del Sudan Black este tie los fosfolpidos y esteroles de membrana de los grnulos.

Tie tanto los grnulos azurfilos inespecficos como los especficos de los neutrofilos

LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tincin de las clulas en maduracin y de los grnulos de los eosinofilos anormales.

2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS

MIELOPEROXIDASA
La demostracin citoqumica de esta enzima se basa en la accin oxidante de la peroxidasa sobre un sustrato (bencidina) en presencia de perxido de hidrgeno, apareciendo un precipitado azul en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reaccin.

BENCIDINA

H2O2 MPO

Resultados.

ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS

GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : MIELOBLASTOS AGRANULARES 30% POSITIVOS.

NEUTRFILO ES SIEMPRE POSITIVO 100% ??

EOSINFILO TAMBIN , PERO COLOR PARDO AMARILLO

BASFILO EN 50% LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS MONOCITOS: POSITIVOS EN GRNULOS DISPERSOS.

ESTRES OXIDATIVO Scorificacin de MPO en granulocitos:

Se categorizaron los neutrfilos de acuerdo al contenido de grnulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4, en orden creciente.
Grado 1: Escasas granulaciones teidas dispersas (fig.3 y 4)

Grado 0: Sin granulaciones teidas. (fig. 1 y 2)

Scorificacin de MPO en granulocitos:

Grado 2: Regulares granulaciones sin cubrir el ncleo (fig. 5) Grado 3: abundantes granulaciones teidas en todo su citoplasma sin llegar a cubrir completamente el ncleo. (fig.6 )

Scorificacin de MPO en granulocitos:

Grado 4: granulaciones que cubren la clula completamente dndoles un aspecto de casquete. (fig.8 y 9)

FOSFATASA ALCALINA

La fosfatasa alcalina es una hidrolasa perteneciente al grupo de las fosfomonoesterasas.

Ligeros cambios de pH determinan una rpida inactivacin de la enzima. Es un marcador de granulaciones secundarias o especificas.

La demostracin citoqumica se basa en la hidrlisis de ciertos substratos, de los cuales se liberan unos productos intermedios que combinados con una sal diazoica dan un precipitado coloreado.

Se encuentran actividad FA en algunas clulas maduras y semimaduras de la granulopoyesis neutrofilica (segmentados y bandas)

La actividad granulocitica de la FA se manifiesta en forma de un precipitado de color pardo negruzco localizado en el citoplasma

ndice de actividad de FAL

Grado 0: sin reaccin Grado I: coloracin difusa o con pequeos puntos coloreados Grado II: mayor densidad cromtica, por lo general en la zona del hilio nuclear. Grado III: mayor granulacin oscura, tie todo el citoplasma.

Grado IV: completamente oscuro

FOSFATASA ACIDA
Se basa en la hidrlisis del substrato naftol-AS-Bi-fosfato.
La aplicacin prctica del estudio de la FA se refiere sobre todo al estudio de los sndromes linfoproliferativos crnicos (LPC) y leucemia aguda linfoblstica (LAL), dnde existe una buena correlacin entre el tipo de positividad y el fenotipo de membrana.

FAC LT(+) Y LB (-)

El 90% de las LAL de origen T dan una reaccin + intensa de localizacin centrosmica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores elevados de FAC que es tartrato sensible. La LLC-B presenta muy escasa actividad al igual que ocurre con otras proliferaciones de linfocitos B.

Tricoleucemia: Tincin fosfatasa cida (+) tartrato resistente

LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA EN MAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.

ESTERASAS
4 sustratos:
Naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) Naftol-AS-D-acetato -naftil-acetato -naftil-butirato

hidrolizados precipitado insoluble sal diazoica

ESTERASAS
Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar steres en sus componentes cidos y alcoholes. Existen diferentes variedades segn el substrato empleado.

GR y su progenie Naftil butirato/ acetato Naftil cloro acetato Normales (-) (+) M6

Granulocitos y su progenie (-) o con algunas granulaciones F Resit (+++++)

Linfocitos y su progenie (-) o + dbil

Monocitos y su progenie (+++++) Fluoruro sensible (+)

Idem

(-)

LMA5 (monocitica) MO TINCION DE ESTERASAS COMBINADAS: monoblastos teidos de marrones (esterasas no especificas) y un neutrfilo teido de azul (cloroacetoesterasa)

EN RESUMEN..
Granulocitos Linfocitos Monocitos Plaquetas Eritrocitos Mb Seg PAS Lbl Lin Mbl Mon Mg Pq PEbl GR

Fe

MPO

FAL

FAC

ANAE

NCAE

Sudan Black