UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD FACULTAD DE TECNOLOGA MEDICA

FIJACIN Y PROCESAMIENTO DE TEJIDOS

Integrante: MARTIN OSORIO, LIZETH

INTRODUCCIN
Mecanismo por el cual preservamos la morfologa de los tejidos, su capacidad inmunoantignica y los cidos nuclecos. Cada fijador tiene ventajas y desventajas

Achicamiento,

hinchazn, endurecimiento

Tipos de fijadores
Fsicos

y qumicos

FIJACIN MTODOS FSICOS

Calor
Como
Como

mtodo primario
una seccin congelada en la laminilla

Poner

mtodo secundario o auxiliar

Acelera

los mtodos qumicos de fijacin y preparacin de tejidos

Microondas
Como

mtodo secundario o auxiliar

Acelera

los mtodos qumicos de fijacin y preparacin de tejidos

FIJACIN MTODOS FSICOS

Congelacin en seco (freeze drying)

Congelamos

el tejido en alguna sustancia congelante (nitrogeno lquido o acetona) y luego lo mantenemos en un vaco

FIJACIN MTODOS QUMICOS

Tres categoras:
Fijadores coagulantes Fijadores entrecrusantes (cross linking) Fijadores compuestos

Coagulacin: proceso qumico por el cual convertimos una sustancia soluble en agua en insoluble

FIJADORES -COAGULANTES

Mecanismo de accin
Coagula

(hace insoluble en agua) los compuestos bsicos de lo que estn hechas las clulas (proteinas). EFECTO ADVERSO: causan pobre preservacin de la ultraestructura (grnulos secretores, mitocondrias, etc.). No son buenos para microscopa electrnica.

FIJADORES -COAGULANTES

Tipos:
Desidratantes
Etanol

(Citologa y secciones congeladas) (Romanowkys)

IHQ+ IHQIHQ+, IF+++

Metanol

Acetona

Acidicos
cido

picrico (Bouins) cido tricloroactico

FIJADORES DESIDRATANTES Y COAGULANTES

Mecanismo de accin
Sustituyen

al agua de los tejido que rodea a las proteinas cambiando la estructura terciaria de las proteinas causando coagulacin (denaturacin de las proteinas)

FIJADORES DESIDRATANTES Y COAGULANTES

Efecto adverso:
Estraccin

de los lpidos de los tejidos

FIJADORES -ENTRECRUSANTES

Mecanismo de Accin

Causan entrecrusamiento de las proteinas y de los cidos nuclecos

Aldehdos
Formaldehdo,

Categoras

glutaraldehdo, hidrato de cloral, glioxal

Sales metalicas
Mercurio,

zinc de osmio

Otros metales
Tetraxido

FIJADORES -ENTRECRUSANTES

FORMALDEHIDO
El

fijador ms utilizado 10% (v/v) = 4% (w/v) neutralizada y amortiguada (neutralized and buffered) = 10% NBF Proceso reversible (IHQ)

FIJADORES -ENTRECRUSANTES

FORMALDEHIDO
Si

no disolvemos el formaldehdo en una solucin amortiguada (buffer) la formalina que se produce es cida. La formalina cida produce un precipitado color negro/marrn en la tincin de H&E. Su efecto mayor es sobre las protenas > cidos nuclecos > lpidos >>> carbohidratos Velocidad de penetracin: 1 mm/h

FIJADORES -ENTRECRUSANTES

GLUTARALDEHDO
Causa

an ms entrecrusamiento que la formalina Preserva mejor la ultraestructura Microscopa electrnica IHQ No reacciona con los carbohidratos o lipidos Velocidad de penetracin: 0.5 mm/h

FIJADORES -ENTRECRUSANTES

TETRAOXIDO DE OSMIO (OsO4)

Txico
Su

efecto mayor es el entrelasamiento de los lpidos y fosfolpidos (membranas celulares) Es electrn-denso Uso como fijador secundario en microscopa electrnica o para realizar tintes especiales de lpidos Velocidad de penetracin: <1 mm/h

FIJADORES -ENTRECRUSANTES

CLORURO DE MERCURIO
Txico
B5 No

se usan de rutina pero son mejores para la fijacin de tejidos hematopoieticos

Sututuido

por sulfato de zinc

Velocidad

de penetracin: 1 mm/h

FIJADORES -COMPUESTOS

Formalin + etanol = formalina alcoholica

Preserva

mejor los carbohidratos, causa menos achicamiento celular y menos endurecimiento GWEF: ayuda a encontrar los ndulos linfticos contenidos en tejidos grasosos

FACTORES QUE AFECTAN LA FIJACIN

Amortiguadores y pH Duracin de la fijacin vs. tamao del bloque Temperatura Concentracin Osmolaridad del fijador

Ideal 400-450 mOsm 10% NBF 1500 mOsm

Aditivos

El fosfato que se usa en 10% NBF se precipita como sal. Puede daar las procesadoras si no se limpian

PROCESAMIENTO DE TEJIDO RUTINA

Macro

Inclusin

Fijacin

Infiltracin

Deshidratacin

Clarificacin

DESHIDRATACIN
Remover agua Proceso necesario para poder hacer la inclusin en medios no acuosos como la parafina Queremos remover el agua libre no el agua dentro de las clulas Demasiado deshidratacin:

causa artefacto y endurecimiento Causa emblandecimiento

Muy poca deshidratacin:

Dos mecanismos de accin:

Por atraccin Por sustitucin

AGENTES DESHIDRATANTES (ALCOHOL)

ETANOL

Mejor de todos Hidroflico Gradacin de alcoholes de suma importancia en el procesamiento de los tejidos:
Reduce achicamiento de las clulas Evita la formacin de sales (interfieren con la microtoma) cuando el fijador esta en una base de fosfato

Regulado por agencias federales y locales Sustituto: Reagent alcohol (alcohol etlico al 95% con metanol e isoproplico, estos aditivos lo hace no consumible por el ser humano) Disposicin regulada

AGENTES DESHIDRATANTES (ALCOHOL)

METANOL
Uso como fijador No como deshidratante

ISOPROPANOL
Sustituto para etanol Precaucin!

La EOSINA es insoluble no se debe de sustituir en la preparacin de tintes especiales

Encoje y endurece menos que el etanol Para procesar plantas y animales

BUTANOL

AGENTES DESHIDRATANTES (ALCOHOL)

ACETONA
Uso

como fijador Achicamiento+++ Voltil Hidrofilico

AGENTES CLARIFICANTES

Se les conoce as porque los tejidos se tornan transparentes cuando se exponen a los mismos Tiene que ser afines tanto con el agente deshidratante (alcohol) como con el agente infiltrante (parafina) Se les conoce como el agente dealcoholizante Remueve el alcohol y prepara el tejido para la infiltracin con parafina Si no hay una buena clarificacin no habr una buena infiltracin Demasiada clarificacin tiene un efecto parecido al de la deshidratacin

AGENTES CLARIFICANTES

XYLENE

Mas utilizado Se pone opaco (lechoso) cuando esta contaminado con agua

Reemplazar inmediatamente

Endurece el tejido Endurece menos el tejido Tolera ms la presencia de agua Las procesadoras automticas condensan agua en la tapa que con los cambios de presin causan que le caiga agua al tejido durante los ltimos pasos del procesamiento

TOLUENO

AGENTES CLARIFICANTES

BENCENO
Rpida evaporacin Difcil de mantener Txico, carcingeno

CLOROFORMO
Lenta penetracin al tejido Rpida evaporacin Difcil de mantener Txico

ACETONE

AGENTES CLARIFICANTES

LIMONENE (Sustituto de Xileno)

Endurecen el tejido Contaminan la parafina Alergias Dificultad respiratoria Dolor de cabeza

HIDROCARBONOS ALIFTICOS
Alkanes Nueva clase de agentes clarificanes Cadenas cortas Unas MARCAR mejores que otras

INFILTRACIN
Medio de soporte (embedding) PARAFINA

Mas comn Sustancia inerte Derivado del petrleo Varan en su punto (temperatura) de fusin [melting point] IHQ usamos con bajo punto de fusin (55-58C) protege antgenos buenas cintas Demasiada infiltracin causa achicamiento y endurecimiento

RECOMENDACIONES

Procese o tenga protocolos distintos para las biopsias pequeas y los tejidos grandes