H P L C

PROF. EMANUEL
H P L C
HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY
HIGH PRECISION LIQUID CHROMATOGRAPHY
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA PRESSO
CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTO DESEMPENHO
CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Mikhail Semenovich Tsvett
Introduzida pelo pesquisador Michael Tsvett
em 1906, quando separou clorofila de uma
mistura de pigmentos de plantas, atravs de
uma coluna cheia de carbonato de clcio em
p, fazendo a lavagem com ter de petrleo.
CROMATOGRAFIA
Conforme a amostra descia pela coluna,
apareciam bandas separadas e cores distintas
ter de
petrleo
CaCO
3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
Do grego:
_eo: chroma, cor

ociv, grafein, grafia

CROMATOGRAFIA
A tcnica pode separar os componentes sem nenhum
aparecimento de cor

escrita
em cores
Ferramenta analtica para a separao de misturas,
combinada com anlises qualitativas e quantitativas das
substncias separadas
Consiste em srie de processos fsico-qumicos de
separao de misturas em funo de suas caractersticas
moleculares
Processo Cromatogrfico
Os componentes das amostras so distribudos entre duas fases,
uma das quais permanece estacionria, enquanto a outra elui
entre os interstcios ou sobre a superfcie da fase estacionria
(F.E.).
O movimento da fase mvel (F.M.) resulta numa migrao
diferencial dos componentes da amostra. O mecanismo envolvido
nesta migrao diferencial vai depender do tipo utilizado de fase
mvel e de estacionria.
Fatores decisivos na separao cromatogrfica:
Natureza da fase estacionria
Concentrao da fase estacionria
Natureza da fase mvel
Vazo da fase mvel
Temperatura
Granulometria
Geometria do suporte
Interaes relacionadas migrao diferencial:
1) Foras de disperso de London ou foras de Van der Waals;
2) Interaes de dipolo induzido;
3) Ligaes de hidrognio;
4) Interaes dieltricas;
5) Interaes eletrostticas e coulombianas.
As variveis que afetarem essas foras intermoleculares
iram influenciar o grau de separao obtido pela passagem
dos solutos atravs da coluna cromatogrfica
Classificao dos mtodos cromatogrficos:
Tipo de suporte
Modo de separao
Natureza da fase mvel
Composio da fase mvel
Objetivo da separao
Coluna
Planar
Adsoro
Partio
Troca inica
Excluso de tamanhos
Afinidade
Cromatografia gasosa
Cromatografia Lquida
Cromatografia supercrtica
Isocrtica
Gradiente
Analtica
Preparativa
Oferece uma grande resistncia vazo da F.M. por isso emprega-se
sistemas de bomba de alta presso (at 400 bars)
A vazo da fase mvel facilmente controlada (=> exatido e preciso)
Vrios tipos de detectores podem ser colocados na sada da coluna,
permitindo uma identificao e quantificao continua dos
componentes da amostra

Separaes em escala preparativa de mg de amostras so relativamente
fceis
Recheio da coluna utilizado apenas uma vez
A aplicao da amostra requer habilidade
A vazo de eluente promovida pela ao da gravidade
As separaes requerem vrias horas
As fraes so coletadas manualmente
CROMATOGRAFIA LQUIDA CLSSICA X HPLC
CLC
desperdcio de
material e tempo
HPLC
Ind. qumica
Meio ambiente
Farmacuticos
consumveis
Anlise clnica
poliestirenos
corantes
ftalatos
tetraciclinas
corticosteroides
antidepressivos
drogas
aminocidos
vitaminas
homocisteina
Bioscincia
Protenas, peptideos
nucleotideos
Lipdios,
Antioxidantes
acares

PAHs
ons inorgnicos
Herbicidas e afins
APLICAES
Requer somente que a amostra seja solvel na fase mvel
CARACTERSTICAS DAS FASES ESTACIONRIAS EM HPLC
Slidos rgidos (slica), semirrgidos
ou no rgidos;
Partculas esfricas ou irregulares
partculas porosas de poliestireno
entrecruzadas com divinilbenzeno
agarose ou
dextrose
Partculas com diferentes dimetros
Partculas porosas ou peliculares;
CARACTERSTICAS DE DIFERENTES RECHEIOS PARA HPLC
TCNICAS DE HPLC
H seis tipos de fases estacionrias com diferentes mecanismos
que regem as separaes cromatogrficas em HPLC. Mediante a
simples troca de coluna e fase mvel possvel utilizar um deles
CROMATOGRAFIA LQUIDO-SLIDO OU POR ADSORO
CROMATOGRAFIA LQUIDO-LQUIDO OU POR PARTIO
CROMATOGRAFIA LQUIDA COM FASE LIGADA
CROMATOGRAFIA LQUIDA POR TROCA INICA
CROMATOGRAFIA LQUIDA POR EXCLUSO
CROMATOGRAFIA LQUIDA POR AFINIDADE
FE utilizada vrias vezes
Versatilidade: basta a amostra ser solvel na F.M.
Alta resoluo
Conveniente para anlise qualitativa
Sensibilidade
Absoro UV-Vis de varivel: 10
-10
g
Fluorescncia: 10
-12
g
Automao
H P L C - VANTAGENS
Auto custo:

Carncia de um detector universal de boa deteco
ndice de refrao:
~
10
-6
g
espectrmetro de massas: US$ 150,000

Experincia do operador
H P L C - DESVANTAGENS
Aquisio
Manuteno preventiva e corretiva
CROMATOGRAFIA LQUIDO-SLIDO OU POR ADSORO
Baseia-se na competio que existe entre molculas da amostra
e as da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um
slido (F.E.).
Se o adsorvente possui uma superfcie polar (slica ou alumina),
grupos apolares (HCs) tero pouca afinidade e no sero retidos.
Interaes: dipolo induzido-dipolo; ligaes hidrognio
forte adsoro eluio por gradiente*
*aumento da polaridade da FM de maneira constante e uniforme, resultando
em um incremento de solubilidade dos componentes da amostra na FM
CH
3
OH /H
2
O
(50/50)
H
2
O (100)
tempo
F

a

s

e





m

v

e

l

eluio por gradiente
Estrutura
inorgnica
da slica
CROMATOGRAFIA LQUIDO-LQUIDO OU POR PARTIO
CLL foi desenvolvida por Martin e Synge em 1941 para separao de
vrios aminocidos, usando fase estacionria de gua em slica e
clorofrmio como fase mvel.
Baseia-se nas diferentes solubilidades que apresentam os componentes
da amostra na fase mvel e na fase estacionria
A solubilidade da FE na FM
rapidamente deteriora a coluna
Saturar FM com FE por
meio de uma pr-coluna
que contenha um alto
teor da FE
CLFL
Slidos microporosos para CLS e como suporte para CLL
CROMATOGRAFIA LQUIDA COM FASE LIGADA (CLFL)
Como a fase estacionria quimicamente
ligada superfcie do suporte, no h mais
solubilidade da fase estacionria na fase mvel
Mecanismos:
Partio e adsoro
Suporte slido
+
Lquido estacionrio
F.E.
Reao
Qumica
VANTAGENS
Alta estabilidade qumica

Liberdade de escolha da F.M.
vazo e temperatura

Eluio por gradiente
Preparo trabalhoso
Menor recobrimento (50%)
2 < pH < 8
DESVANTAGENS
Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionria possvel obter
diferentes tipos de seletividade. Estes grupos podem ser polares ou apolares
Reao Siloxano
FASE NORMAL
FASE REVERSA
Ciano:
Amino

Diol - (CH
2
OH)
2
Nitro - NO
2
N-alquil
C
4
C
8
C
18
Fenil
FE POLAR : FM APOLAR
FE APOLAR : FM POLAR
FASE NORMAL:
Comportamento na reteno
Polaridade dos componentes da amostra:
Polaridade
da fase mvel
alta
baixa
Solventes (F.M.)
n-Hexano
Iso-octano
Clorofrmio
Diclorometano
Isopropanol
Tetrahidrofurano
Dioxano
Acetonitrila
Etanol
Metanol
Aminas
cidos
C

a

r

t

e

r



a

p

o

l

a

r

FASE REVERSA
Parmetros importantes
Fora do solvente
A gua um solvente fraco. Quanto mais orgnica a fase, menor
a separao. A fase orgnica deve ser miscvel com gua.
Escolha do sistema de solventes (fase mvel)
75% CH
3
OH / 25% H
2
O
60% CH
3
OH / 40% H
2
O
50% CH
3
OH / 50% H
2
O
1. Hemissulccinato de hidrocortisona
2. Metilparabeno
3. Hidrocortisona
4. Propilparabeno
5. Acetato de hidrocortisona
6. Acetato de cortisona

FM: 45% CH
3
OH / 55% H
2
O FM: 30% CH
3
CN / 70% H
2
O
FASE REVERSA
Parmetros importantes
pH da fase mvel
> Hidrofobicidade > tempo de reteno
Composto cido: pH t
RET
Composto bsico: pH t
RET

pH

t
R
E
T

1. ac. Saliclico 2. fenobarbitona 3. fenacetina
4. nicotina 5. metilanfetamina
30x0,4cm C18 2mL/min
10mm UV 220nm
Composto neutro: indiferente
FASE REVERSA
Interaes
FASE REVERSA:
Comportamento na reteno
POLARIDADE DA FASE MVEL
Baixa
Alta
Coluna: Finepak SIL C18
FM: CH
3
CN / H
2
O
70/30 60/40 50/50
p-hidroxi-etilbenzoato

p-hidroxi-propilbenzoato

p-hidroxi-butilbenzoato
Comprimento da
cadeia carbnica
< <
FASE REVERSA:
Comprimento da cadeia
carbnica do recheio da coluna
FM: 40%CH
3
CN / 60%H
2
O
p-hidroxi-etilbenzoato

p-hidroxi-propilbenzoato

p-hidroxi-butilbenzoato
Coluna: Finepak SIL C18
Coluna: Finepak SIL C8
Coluna: Finepak SIL C4
Comparao entre fase reversa e fase mvel
Fase estacionria
Fase mvel
Interao
Ordem de eluio
Fase normal Fase reversa
Alta polaridade
Baixa polaridade
Lig. H e int. dipolo
De apolar para polar
Baixa polaridade
Alta polaridade
Hidrofbica
De menor para maior
comprimento
CROMATOGRAFIA LQUIDA POR TROCA INICA CTI
Consiste na troca de ons de mesmo sinal entre uma soluo e um
corpo slido* muito insolvel atravs de adsoro reversvel e
diferencial dos ons da fase mvel pelo grupo trocador matriz
*resina de troca inica: polmeros portadores de carga eltrica que possuem ons
ativos que permutam reversivelmente de posio com outros ons de uma soluo
F.E. altamente carregada, sendo que solutos com cargas de sinais
contrrios a elas so seletivamente absorvidas pela fase mvel. Os
solutos absorvidos podem ser subsequentemente eludos, por
deslocamentos com outros ons, com mesmo tipo de carga porem
com maior fora de interao com a F.E.
A F.M. um soluo salina aquosa, frequentemente com uma
pequena porcentagem de solvente orgnico, podendo ser
tamponada se necessrio
CROMATOGRAFIA LQUIDA POR TROCA INICA CTI
Grupos quimicamente ligados, usados para troca inica
-SO
3
-
: trocadores fortes de ctions
-CO
2
-
: trocadores fracos de ctions
-NR
3
+
: trocadores fortes de nions
-NH
2
R
+
: trocadores fracos de nions
Resinas catinicas: adquiridas na forma de sais de Na
+
ou de on H
+
Resinas aninicas : adquiridas na forma de Cl
-
T
r
o
c
a
d
o
r

a
n
i

n
i
c
o

T
r
o
c
a
d
o
r

c
a
t
i

n
i
c
o

1. CONDIES
INICIAIS
2. ADSORO
DO CTION
3. DESSORO
DO CTION
4. REGENERAO
F
-
: nion fixado C
+
: Contraon S
+
: ction da soluo
(Res A
-
)Na
+
+ S
+
(ResA
-
)S
+
+ Na
+

MECANISMO DA RETENO: troca inica
Caractersticas da resina
Ser reticulada

Apresentar solubilidade desprezvel

Hidroflica

Permitir a difuso dos ons atravs da estrutura

Conter nmero suficiente de grupos trocadores de ons
acessveis (capacidade de troca inica)

Ser quimicamente estvel
Ocorre como consequncia das diferenas no tamanho,
densidade de carga e estrutura dos diferentes solutos inicos
SEPARAO EM CTI
Cresce com o aumento da carga dos ons permutantes
Ex: Na
+
< Ca
2+
< Al
3+
< Th
4+

Cresce com a diminuio do tamanho do on hidratado.
Li
+
< H
+
< Na
+
< NH
4
+
< K
+
< Rb
+
< Cs
+


A afinidade relativa do on de maior carga cresce em proporo
direta com a diluio
troca inica
Deteco
Condutividade eltrica
Permite a determinao de espcies inicas orgnicas e inorgnicas
Sensibilidade a baixas concentraes (g L
-1
)
Tempo de anlise (15 min)
Pequenos volumes de amostra (1 mL)
Custos ()
Equipamento e treinamento
Produtos qumicos (eluente e regenerante)
Mo de obra especializada
CTI VANTAGENS E DESVANTAGENS
Fases estacionarias usadas em CTI
CROMATOGRAFIA LQUIDA POR EXCLUSO C.E.
A separao baseada no tamanho da molcula e no em fenmenos de
interaes fsicas ou qumicas
FASE ESTACIONRIA: Partculas com dimetro
mdio de poro fabricado sob medida. Assim,
algumas molculas (menores) podem entrar nos
poros pequenos, outras nos poros mdios, ou
seja, so permeadas seletivamente. As
molculas grandes so excludas .
Molculas de tamanhos dentro do intervalo sero separadas totalmente ou
parcialmente de acordo com a seletividade caracterstica de cada material.
intervalo de
tamanhos
limite de permeao
abaixo do qual todas as molculas de
menor tamanho so igualmente
difundidas dentro dos poros do material
limite de excluso
acima do qual todas as molculas so
muito grandes para penetrar nos poros
(Lim. Superior)
(Lim. Inferior)
Molculas
grandes
Molculas
pequenas
Coluna
Partculas
porosas
CROMATOGRAFIA LQUIDA POR EXCLUSO C.E.
Cromatografia de Permeao em Gel
Permeao em gel
Poliestireno poroso com ligaes cruzadas
Solvente orgnico (THF, CH
3
Cl, DMF)
Distribuio de polmeros por massa molar
Separao de oligopolmeros sintticos
No aquosa
Interao
F.E.
F.M.
Amostra
Cromatografia de Filtrao em Gel
Permeao em gel
Slica gel / polmero poroso (ambos hidroflicos)
Soluo tampo
Separao de polmeros hidrossolveis (protenas,
cidos nucleicos, sacardeos)
No aquosa
Interao
F.E.
F.M.
Amostra
C P G
C F G
Mecanismo de separao em C.E.
Fase
mvel
Pequeno
poro
Recheio
da coluna
Fases estacionarias usadas em C.E.
Gis de polidextrano (Sephadex), poliacrilamidas (Bio-Gel P ) e
poliagaroses (Sepharose e Bio Gel A), usados quase sempre
com fases mveis aquosas. Sua capacidade elevada mas eles
no resistem a presses superiores a 3 bars; ento, so usados
somente na CE clssica
Resistem a presses da ordem de 100 a 150 bars. Estes
materiais so constitudos de microesferas de algum
copolmero, como o poliestireno-divinilbenzeno. Podem ser
empregados com fases mveis aquosas ou no aquosas e
existem em uma grande variedade de porosidade
No rgidos
Semirrgidos
Resistem a qualquer presso e so geralmente constitudos de
partculas de slica porosa ou de vidro poroso. Devido a sua
rigidez podem-se obter separaes muito rpidas com fluxo
de fase mvel muito alto
Rgidos
Fases estacionarias microporosas em C.E.
Fracionamento de protenas e outros
polmeros hidrossolveis

Controle de qualidade de polmeros de alta
massa molar (assegurar propriedades fsicas)

Separao polmeros de baixa massa molar
(ex: poliestireno, ftalatos)
Aplicaes da C.E.
CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE
Aplica-se separao de qualquer espcie biolgica que seja
capaz de formar um complexo dissociavel com uma outra espcie
(protenas, cidos nucleicos, e at mesmo uma clula inteira!)
Princpio: adsoro e dessoro altamente seletivas
A seletividade obtida pela utilizao de molculas
anexadas resina cromatogrfica, que se ligam
especificamente a determinados compostos
(sistema chave e fechadura)
CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE Mecanismo
De reteno
O ligante especfico imobilizado
em um suporte slido inerte.
Amostra constituda de uma
mistura de macromolculas passa
pela coluna, mas somente a
espcie de formato complementar
ao ligante adsorvida, as demais
so eludas sem reteno
Suporte slido esfrico
(agarose)
Ligante A
Enzima A
Mistura de protenas
Brao espaador
(hexametilenodiamina)
Acoplamento da enzima desejada
Tampo de lavagem
Remoo das demais protenas
Tampo de eluio
Recuperao e isolamento
da enzima A
F.E. Regenerada e reutilizvel
Isolamento da lecitina do germe de trigo usando N-acetil-D-glucosamina
como ligante. Condies cromatogrficas: coluna de vidro AP1 Waters,
100 x 100 mm D.I.; fluxo1 mL/min; deteco, absorbncia UV em 280 nm
minutos
CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE
Seleo correta da fase estacionria
Seleo correta da fase estacionria
Seleo correta da fase estacionria
Caractersticas das colunas para HPLC
Tubo de material inerte com d. i. uniforme capaz de resistir altas
presses (ao inoxidvel e PEEK), podendo ser de vidro para uso
em baixas presses
D.i. e comprimentos adequados para aplicaes especficas
Retas ( 10 a 50 cm de comprimento)
Eficincia de at 60.000 pratos tericos por metro de coluna
A seleo da coluna baseada no mecanismo de separao da
fase estacionria
Colunas Dimetro
interno
Comprimento
preparativas > 10 mm 10 50 cm
analticas 1 5 mm 10 30 cm
microcolunas 0,05 1 mm 2 10 cm
COLUNAS PARA HPLC
O comprimento das colunas varivel, sendo comuns colunas
analticas de 10-30 cm e preparativas em torno de 10-50 cm.
Essas colunas so reaproveitveis, sendo empacotadas com
suportes de alta resoluo, no h necessidade de regenerao
aps cada separao.
COLUNAS PARA HPLC
COLUNAS PARA HPLC
Cuidados:
Usar solventes de alta pureza

Filtrar F.M. ( de 0.2 m)
Previne entupimento dos tubos,
danos ao pisto e vlvula injetora

Solventes halogenados podem conter traos de HCl
ou HBr, que podem reagir com o ao inoxidvel da
coluna e outras partes do sistema
EFEITO DA TEMPERATURA APLICADA
COLUNA SOBRE O TEMPO DE RETENO