Journal Club - Virologia

Ana Martins, Ana Carvalhido, Joana Coelho, Marta Costa

L9
Enterovirus humano (HEVs) e parechovirus (HPeVs)
manifestaes suaves no trato respiratrio e gastrointestinal,
doena mo-p-boca, miocardite, sepsis neonatal e infees
no SNC.
Recordando
O mtodo clssico de diagnstico destas
infees tem sido o isolamento do vrus
seguido de cultura celular de amostras
de fezes, exsudados da garganta, lquido
cerebro espinal e sangue.
Efeito citopatolgico
do HPeV semelhante
ao HEV clssico
Cultura celular Standard para HEV:
3 linhas celulares clulas do rim do macaco
fibroblastos humanos


Cultura celular Standard para HPeVs no est bem definida
Neutralizao com
anticorpos especficos
para determinar o
serotipo
Recordando
Linhas celulares
Standard para HEV
no suportam o
crescimento de todos
os HPeV
HPeV1 e HPeV2
podem ser
identificados. Acs
para identificar
outros serotipos no
esto disponveis.
HEV
5UTR (altamente conservado deteo por PCR

HPeV
Sequncias de nucletidos diferentes PCR no deteta


PCR especficos 5UTR desenvolvimento uso em HPeV

5UTR no discriminativo o suficiente para tipagem



Tipagem por sequenciao da regio VP1
Recordando
Tipagem por sequenciao de parte da regio VP1 est de acordo com a
serotipagem por neutralizao, pois os anticorpos especficos utilizados so
direcionados para a regio VP1.
A tipagem molecular dos diferentes tipos VHE / HPEV pode ser feito
diretamente a partir da amostra por sequenciamento da regio cpside

Recordando
No sei o que fazer com este slide
Apesar das tcnicas moleculares de identificao e tipagem, alguns
laboratrios continuam a preferir as culturas celulares e serotipagem
falta de validao das suas execues.
Estabelecer a eficcia das linhas
celulares que suportam o
crescimento do vrus.
Comparar o rendimento da
genotipagem diretamente das
fezes com a serotipagem por
neutralizao num sistema de
cultura celular otimizado.
1. Objetivo
HEVe HPeV detetados
por PCR de amostras de
fezes de doentes
hospitalizados
HEV e HPeV detetados
pela cultura celular em
estudo
2. Mtodos
2.1 Amostras clnicas

2.2 Cultura viral e serotipagem

A cultura viral foi realizada por co-cultura de material de paciente
em clulas tercirias de rim de macaco (TMK), clulas Vero,
fibroblastos de pulmo embrionrio humano (HEL), clulas de
carcinoma do clon humano (HT29), clulas de
rabdomiossarcoma (RD), e os fibroblastos de pulmo humano
(A549) .
2.3 Extrao e deteo de RNA

Extrao por mtodo de extrao automtico
Uso de um kit de isolamento de cido nucleico total com o instrumento
MagnaPureLC instrument
PCR em tempo real (c-DNA) usando o LC480 (Roche Diagnostics)


HEV-specific duplex assay
Primers:
Entero-1-TM (5-ggCCCTGAATGCGGCTAAT-3, 452468)
Entero-2-TM (5-gggATTGTCACCATAAGCAGCC- 3, 579597)
Probes FAMHEVMGB (5-GCGGAACCGACTACTTTGGGT-3, 531551)
VICICMGB (5-CTTGAGACGTGCGTGGTAACC-3)

HPeV single-target assay
Primers:
ParechoF31 (5-CTGGGGCCAAAAGCCA-3, 441457)
K30 (5-GGTACCTTCTGGGCATCCTTC-3, 584572)
Probe FAMHPeVMGB (5-AACACTAGTTGTA(A/T)GGCCC-3, 577556).
NEM COM ESTE!
HPEV-positivas:
Gene VP1completo (736 pb) foi amplificado e sequenciado utilizando o
conjunto de primers recentemente desenvolvido VP1-parEchoF12 e VP1-
parEchoR12

VHE-positivas:
Abordagem Nix et al.(2006) foi adotada

Comparao com
as sequncias de
VP1 de HEV e
HPeV de estirpes
de referencia e
filogeneticamente
caracterizadas
fragmentos
amplificados
foram purificados
a partir de gel de
agarose e
sequenciados
fragmento de
350-400 pares de
bases do gene da
VP1
amplificao de
um fragmento de
992 pb
abrangendo os
genes VP1 e VP3
BigDye Terminator reaction kit
on an ABI 3730/ 3100 DNA
analyzer
2.4 Genotipagem direta
1174 pacientes testados para HEV e HPeV
1460 amostras (mais que uma em alguns pacientes)
3. Resultados
3.1 Epidemiologia dos pacientes positivos para HEV e HPeV

Mais frequente nos meses de
Vero e em crianas abaixo dos 5
anos
Infeo aumentou no Inverno de 2007 e no
Vero de 2008 e apresenta maior frequncia em
crianas com menos de 5 anos
3.1 Epidemiologia dos pacientes positivos para HEV e HPeV

3.2 Deteo de HEV e HPeV por cultura celular

No percebi o
paragrafo anterior
ento nem sei se
importante, vejam
27 (10%) das estirpes com um Ct > 32 ciclos (baixa carga viral) ainda podem ser
cultivadas, sendo que a maioria foi identificada como Coxsackievirus B (CBV) e Echovirus;
43 (16%) das estirpes com um Ct < 32 ciclos indicaram elevada a moderada carga viral,
mantendo-se negativa em cultura. Por genotipagem foram identificadas como HPeV e
Coxsackievirus A (CAV).
3.2 Deteo de HEV e HPeV por cultura celular

A capacidade de propagao
em cultura celular das
estirpes est relacionada com
a carga viral expressa em Ct
obtido por PCR em tempo
real

Vrus no pode ser cultivado
quando Ct>37,17 ciclos


Amplificao e sequenciao de uma parte da regio VP1 da cpside
diretamente da amostra de fezes:

3.3 Tipagem de HEV e HPeV

58 (43.3%) das 134 estirpes de HEV e 67 (51.1%) das 131 estirpes de
HPeV poderam ser genotipadas.
A partir de 3 amostras identificadas como duplo positivo, tanto
estirpes de HEV como de HPeV poderiam ser genotipadas.
Estes serotipos foram confirmados por genotipagem da cultura isolada como
Echovirus 6, 11, 25, e 30 (n = 2); CAV2, 4, e 9; CBV2 e 3; e HPeV1 (n = 2)
No total, poderiamos identificar 125 (47%) das estirpes de VHE / HPEV em
265 por genotipagem e 66 (25%) em 265 por serotipagem.
3.3 Tipagem de HEV e HPeV