A LA IRRADIACION ULTRAVIOLETA INTRODUCCIN La CURVA DE SUPERVIVENCIA es la curva porcentual de bacterias vivas respecto del total de las persistentes en el medio. Se mantiene al principio, descendiendo posteriormente cuando los diversos factores adversos han actuado en el tiempo necesario para matar los microorganismos. Es muy difcil que llegue a ser cero, porque siempre hay algunos microorganismos que son capaces de sobrevivir. Los principales factores que intervienen, son: Humedad relativa, temperatura, oxgeno, materia orgnica y radiaciones.
La radiacin ultravioleta tiene un efecto letal y mutagnico que depende de su longitud de onda, ello se debe a la absorcin selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas molculas biolgicas:
Molculas biolgicas Longitud de onda (nm) de UV ADN y ARN(bases pricas y pirimidicas) 260nm
Las protenas : oEnlace peptdico o Aminocidos aromticos
230nm 280nm
Esta bien establecido que la muerte de las clulas por radiacin UV se debe principalmente a su accin sobre el ADN, de manera que la radiacin de 260nm es la ms efectiva como agente letal,produciendo dmeros de pirimidinas. Cuando hay dos pirimidinas sucesivas en la misma hlice la luz UV hace que se produzcan puente de hidrgeno entre ambas. Los ms frecuentes son los dmeros de timinas que inhiben la replicacin y funciones de ADN. Dmeros de Timina
El tipo mas frecuente de radiacin UV que se usa en mutagnesis es la lmpara microbicida, la cual emite grandes dosis de radiacin UV en la regin de 260nm. La radiacin UV es muy til en el aislamiento de mutantes a partir de cultivo bacteriano. OBJETIVOS Determinar la curva de supervivencia a la irradiacin UV que presenta Escherichia coli en fase logartmica media . Determinar el tiempo en que se obtiene el 0.1% de sobrevivientes ,usado para el aislamiento de mutantes .
Materiales Material Biolgico: - Cultivo de Escherichia coli en fase logartmica media. Material y Equipo de laboratorio : - Placas Petri . - Tubo de ensayo de 300 x 100 ml - Pipetas de 1.5 y 10 ml - Centrifuga - Lmpara de luz UV (30 Watts).
- Buffer Fosfato 0.2 M pH 7.2 - Solucin yodada - Tubo n1 de Nefelmetro de Mac Farland. Medios de cultivo : - Agar nutritivo - Caldo nutritivo
PROCEDIMIENTO Cultivo de E. coli Suspensin de E. coli Equivalente al tubo N3 de Nefelmetro de Mac Farland 15ml SSF Centrifugar a 4500rpm x 15 min Eliminar sobrenadante Resuspender en 15 ml de buffer fosfato Centrifugar Eliminar sobrenadante Equivalente al tubo N1 de Nefelmetro de Mac Farland Suspensin equivalente al tubo N1 de Nefelmetro de Mac Farland De la suspensin colocar 1.5 ml por cada placa. 30 segundos 0segundos
FOTORREACTIVACIN: Por la enzima Fotoliasa codificada por el gen phr. Mediante un fotn deshace el dmero de Timinas.
TRANSFERRASA DE GRUPOS ALQUILO (METILO O ETILO):
SISTEMAS DE REPARACIN POR ESCISIN
Reparacin de los daos de la luz UV (Endonucleasa uvrABC): La Endonucleasa uvrABC es una escilnucleasa codificada por los genes uvrA, uvrB y uvrC que corta el ADN. La Helicasa II de ADN separa las dos hlices y retira 12 nucletidos. La ADN polimerasa I rellena el hueco producido por la Helicasa II y la Ligasa sella los extremos.
Reparacin AP: reparacin de las sedes apurnicas o apirimidnicas. La llevan a cabo las Endonucleasas AP de la clase I que cortan por el extremo 3' y las de la clase II que cortan por el extremo 5'. Una exonucleasa elimina una pequea regin que contiene entre dos y 4 nucletidos, la ADN polimerasa I rellena el hueco y la Ligasa sella los extremos. Reparacin por escisin: daos UV