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CURVA DE SUPERVIVENCIA

DE LAS BACTERIAS FRENTE


A LA IRRADIACION
ULTRAVIOLETA
INTRODUCCIN
La CURVA DE SUPERVIVENCIA es la curva
porcentual de bacterias vivas respecto del total de
las persistentes en el medio. Se mantiene al
principio, descendiendo posteriormente cuando los
diversos factores adversos han actuado en el
tiempo necesario para matar los microorganismos.
Es muy difcil que llegue a ser cero, porque
siempre hay algunos microorganismos que son
capaces de sobrevivir. Los principales factores que
intervienen, son: Humedad relativa, temperatura,
oxgeno, materia orgnica y radiaciones.




La radiacin ultravioleta tiene un efecto letal y
mutagnico que depende de su longitud de
onda, ello se debe a la absorcin selectiva de
longitudes de onda por parte de ciertas
molculas biolgicas:








Molculas biolgicas Longitud de onda (nm) de UV
ADN y ARN(bases pricas y
pirimidicas)
260nm


Las protenas :
oEnlace peptdico
o Aminocidos aromticos


230nm
280nm

Esta bien establecido que la muerte de las
clulas por radiacin UV se debe
principalmente a su accin sobre el ADN, de
manera que la radiacin de 260nm es la ms
efectiva como agente letal,produciendo
dmeros de pirimidinas.
Cuando hay dos pirimidinas sucesivas en la
misma hlice la luz UV hace que se produzcan
puente de hidrgeno entre ambas.
Los ms frecuentes son los dmeros de timinas
que inhiben la replicacin y funciones de ADN.
Dmeros de Timina

El tipo mas frecuente de radiacin UV que se usa
en mutagnesis es la lmpara microbicida, la
cual emite grandes dosis de radiacin UV en la
regin de 260nm.
La radiacin UV es muy til en el aislamiento de
mutantes a partir de cultivo bacteriano.
OBJETIVOS
Determinar la curva de supervivencia a la
irradiacin UV que presenta Escherichia coli
en fase logartmica media .
Determinar el tiempo en que se obtiene el
0.1% de sobrevivientes ,usado para el
aislamiento de mutantes .

Materiales
Material Biolgico:
- Cultivo de Escherichia coli en fase logartmica
media.
Material y Equipo de laboratorio :
- Placas Petri .
- Tubo de ensayo de 300 x 100 ml
- Pipetas de 1.5 y 10 ml
- Centrifuga
- Lmpara de luz UV (30 Watts).


- Buffer Fosfato 0.2 M pH 7.2
- Solucin yodada
- Tubo n1 de Nefelmetro de Mac Farland.
Medios de cultivo :
- Agar nutritivo
- Caldo nutritivo


PROCEDIMIENTO
Cultivo de E. coli Suspensin de E. coli
Equivalente al tubo
N3 de Nefelmetro
de Mac Farland
15ml SSF
Centrifugar a 4500rpm
x 15 min
Eliminar sobrenadante
Resuspender en 15
ml de buffer fosfato
Centrifugar
Eliminar
sobrenadante
Equivalente al tubo
N1 de
Nefelmetro de
Mac Farland
Suspensin
equivalente al tubo
N1 de Nefelmetro
de Mac Farland
De la suspensin colocar 1.5 ml
por cada placa.
30 segundos
0segundos

10segundos
20 segundos
55 segundos
50 segundos
45 segundos
35 segundos
40 segundos
Irradiacin
U.V

REPARACIN DIRECTA DE LAS
LESIONES EN EL ADN

FOTORREACTIVACIN: Por la enzima Fotoliasa
codificada por el gen phr. Mediante un fotn
deshace el dmero de Timinas.

TRANSFERRASA DE GRUPOS ALQUILO (METILO
O ETILO):


SISTEMAS DE REPARACIN POR
ESCISIN


Reparacin de los daos de la luz UV (Endonucleasa uvrABC): La
Endonucleasa uvrABC es una escilnucleasa codificada por los
genes uvrA, uvrB y uvrC que corta el ADN. La Helicasa II de ADN
separa las dos hlices y retira 12 nucletidos. La ADN
polimerasa I rellena el hueco producido por la Helicasa II y la
Ligasa sella los extremos.

Reparacin AP: reparacin de las sedes apurnicas o
apirimidnicas. La llevan a cabo las Endonucleasas AP de la clase
I que cortan por el extremo 3' y las de la clase II que cortan por
el extremo 5'. Una exonucleasa elimina una pequea regin
que contiene entre dos y 4 nucletidos, la ADN polimerasa I
rellena el hueco y la Ligasa sella los extremos.
Reparacin por escisin: daos UV

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