Coloracin

TM Patricia Toledo R.
9000 aos de antiguedad
Antecedentes
Tela Herodes del primer
siglo antes AC.
b) Se observa la parte
alta de un recipiente de
cermica descubierto en
Tel Shiqmona cerca de
Haifa en Israel (Siglos
VIII a IX AC).
Prpura de Tilo (1700 a.c
Rubia, Alizarina .
Imperio Romano
Orcena
Tejidos pigmentados
Introduccin
1714. Van Leeuwenhoek usa azafrn de
vino para destacar fibras musculares.
Uso de colorantes naturales.




1856 Inicio colorantes derivados de
anilinas
Fundamento

Los tejidos tienen la propiedad de
fijar e incorporar de modo
variable diversas sustancias
coloreadas llamadas colorantes.
Color
Si refleja toda la radiacin la retina lo
percibe como blanco, y si absorbe todo en
negro.
El color visible es el complementario del
color espectral absorbido.
Color
Absorciones
parciales los
fotorreceptores
retinianos
captan el espectro
complementario de
la
radiacin absorbida,
producindose la
percepcin de los
colores.
COLORANTE
Una sustancia que, puesta en
contacto con un soporte
adecuado, se une a l de forma
perdurable transmitindole su
color.
Clasificacin por origen:
NATURALES ARTIFICIALES
Siglo XIX
INDIGO
CROMOFOROS

Los radicales responsables de la
modificacin molecular a la que
se debe la aparicin del color
Estructura de los colorantes
Soporte bsico de los colorantes.
Anillo Quinoide en resonancia.
Resonante absorve en UV
Fijo en espectro visible.
Quin lo fija?: los cromforos
Tres anillos benceno.
Tres anillos fusionados
Antraquinona
Xantenos
TIAZINA
Cromforos
Etileno
C=C
Carbonilo
C=O
Tiazlico
C=S
Imino
C=N
Azoico
N=N
Nitroso
N=O
Nitro NO2
CROMOGENO


Anillo
quinoide
Cromforo
Cromgeno
AUXOCROMO
POTENCIADORES DEL COLOR.
Poseen carga elctrica, lo que da carcter
cido o bsico a los colorantes.
Son responsables que un colorante tenga
mayor o menor afinidad por estructuras.
Estos grupos le confieren la capacidad de
disociarse electrolticamente o de formar
sales con los tejidos.
Grupos auxocromos
1. Radical hidroxilo -OH
2. Radical carboxilo -COOH
3. Radical amino NH2
4. Radical sulfhidrilo -SH
5. Cromo
6. Hierro
7. Aluminio
8. Molibdeno
CLASIFICACION SEGN
CROMOFORO
1. Nitrocolorante
2. Colorante azoico
3. Antraquinona
4. Acridina
5. Oxacina tiacina acina
6. Trifenil metano
7. Xanteno
8. Ftalocianina de cobre
Colorantes nitrados y nitrosados
El ms simple es
2,4,6 trinitrofenol o
cido pcrico.
Colorantes azoicos

Monoazoicos:
orange G, Ponceau
de xilidina
Poliazoicos: rojo
congo, sudn rojo y
negro.
Derivados de antroquinona
Rojo de alizarina S.

Radical Carbonilo C=O
Derivados de acridina.
Son derivados de la
molcula de acridina
y que contienen un
cromforo >C=N-
(imino)
Ej. Naranja de
acridina
Derivado de iminas +
Poseen DOS grupos cromforos, se
clasifican:
1.Derivados Oxacnicos: C=N + C=O
2.Derivados Tiacnicos: C=N + C=S
3.Derivados Acnicos: C=N + C=N


IMINO C=N; CARBONILO C=O; TIAZOLICO C=S
Violeta de cresilo.
Derivado oxacnico
IMINO







CARBONILO
Derivado tiacnico. Piel A. de
toluidina
C=S TIAZOILICO
Derivado acnico
Rojo Neutro
Derivados de difenilmetano y
trifenilmetano

Su grupo cromforo es >C=N (imino)
Los colorantes de ste grupo son cidos o
bsicos, dependiendo de los auxocromos
vinculados a la molcula.
Verde luz
Fuscina
Derivados del Xanteno
Con cromforos
variables, entre los
que se encuentra
pironina, eosina,
rodamina y
sulfaftalena.
eosina
Eosina Y
Colorantes derivados de
ftalocianinas
Contienen 2 a 4
grupos isotiouronio
alrededor de un
tomo de cobre para
formar una molcula
que recuerda
vagamennte el anillo
hem.
Ej. Azul y amarillo de
alcian

FISICO
FISICO - QUIMICO
HISTOQUIMICO
MECANISMOS GENERALES DE
COLORACION
.
MECANISMO FISICO
Tinciones de grasas.
colorante es ms soluble en el tejido
que en el disolvente
Impregnaciones:
una precipitacin selectiva se forman
agregados insolubles, quedando
atrapado entre la malla de clulas y
fibras que constituyen los tejidos
formacin de uniones
intermoleculares por atraccin
electroesttica (cargas contrarias) o
por fuerzas de tensin superficial
(debidas a las fuerzas de gravitacin
generadas al disponerse las
molculas muy prximas entre si)

MECANISMO FISICO-
QUIMICO
estn basados en el desarrollo de
una reaccin qumica entre el
colorante (comnmente un
leucoderivado) y la estructura objeto
de tincin de forma que al
interaccionar ambos produce un
nuevo cromgeno responsable del
color obtenido.

MECANISMO HISTOQUIMICO
Tipos de Coloraciones
Progresivas
Regresivas.
Diferenciador
Diferenciacin
Se extrae exceso de colorante con:
Agua
Alcoholes
cidos
Bases
Soluciones metlicas
COMO SE UNE EL
COLORANTE AL
SUSTRATO?
RELACIONES ELECTROESTATICAS
ENLACES COORDINADOS
MORDIENTES
QUELANTES
PUENTES DE HIDROGENO
INTERACCIONES HIDROFOBICAS
IMPREGNACIONES
Temperatura
PARTICIPAN
Unin electroesttica
Carga + Carga -
Sal insoluble


Dye cationico
Atraccin electrovalente. Enlace inico.
proteoglicano
protena
H3N+
OSO3- NH3+
SO3-
Dye anionico
Residuos cidos de los tejidos
Fenoles
Carboxilos
Fosfatos
Sulfatos
Efecto de pH.
Sulfatos, Fosfatos y
Carboxilos ionizados
pH 10
Sulfatos y fosfatos
ionizados.
pH 5-7
Solo sulfatos ionizados.
pH -de 4
Efecto pH
pH cido
H alta
cantidad
pH cido
Ionizados
Aminos
Fuertes
tinciones de
citoplasma
Eosina
Efecto pH
T
E
J
I
D
O

NH3+
NH3+
COO -
AZUL DE
METILENO +
EOSINA -
Efecto de sales
T
E
J
I
D
O

NH3+
NH3+
COO -
Cl-
Cl-
Mordientes
Mordientes: iones metlicos
Unen covalentemente.
Generan complejos de
Coordinacin.
Sales di o tri valentes
Alumbre aluminio y potasio
Mordientes metlicos: alumbres
Aluminio
Hierro
Cromo
Molibdeno
Enlace coordinado
Mordiente
ANTES
DURANTE
Mordientes
Colorante Mordiente


ENLACE COVALENTE
Se forma entre el auxocromo y el sustrato (grupos OH
o amino)
COMPLEJO COLORANTE + MORDIENTE +
SUSTRATO.
Enlace muy fuerte
Puentes de Hidrgeno
Unin dbil
Soluciones acuosas
Altamente selectivos
pH independientes
EJ Coloracin de Rojo Congo.
T
E
J
I
D
O

NH3+
NH3+
COO -
T
E
J
I
D
O

NH3+
NH3+
COO -
Azul de
metileno
+
CL-
CL-
Azul de
metileno
+
Fuerzas de Vander Waals
Atracciones electroestticas entre electrones de un tomo y
el ncleo de otro.
Distancia hasta 0.12-0.2nm
Importante para tinciones de fibras elsticas.
Son ms importantes en la selectividad que en unin.





Disolucin Diferencial
Interacciones Hidrofobicas
Oil Red
en una impregnacin se forman
agregados metlicos insolubles que
quedan retenidos en el tejido gracias a la
malla molecular creada en el proceso de
fijacin.
IMPREGNACIONES
Colorantes nucleares
Hematena + laca
Hematena NO
lacada
Hematoxilina, cristales rosado-
amarillentos solubles en agua y alcohol.
COLORANTE

HEMATOXILINAS
COLORANTE + SOLVENTE
OXIDANTE
GRUPOS AUXOCROMOS
SOLVENTE GENERAL
pH
MADURACION DE LA HEMATOXILINA
Agentes:
Oxigeno ambiental (4 A 6 semanas)
Oxido Rojo de Mercurio
Yodato de Sodio/ Potasio
Permanganato de Potasio minutos
Dicromato de Potasio
Clorato de Potasio


Agentes Oxidantes
Crucial tiempo de accin y
cantidad de agente oxidante.
Generacin de leucoderivado
(exceso)
Coloracin parda e
inespecfica (sobre oxidacin)
Maduracin Inducida
Para 1 gr de Hematoxilina, se usa:
Oxidacin inducida
Oxido de mercurio 0,5 g
Yodato de sodio 0,05g
Permanganato de Potasio 0,177g
Dicromato de Potasio 0,28g
Clorato de potasio 0,11 g
Hematoxilina sobre oxidada
SOLVENTE ESTADO
acuosa neutra Sobreoxidacin
glicerina-alcohol mayor duracin
Bsicas aceleran oxidacin
cidas retardan oxidacin
Estabilidad Hematena
OH
COOH
NH2
SH
IONES METALICOS: Cr, Al, H,
Mb, Pb, Cu.
AUXOCROMOS
Incrementar capacidad tintorial
Afinidad por ncleos celulares
Carcter fuertemente bsico
Sales metalicas bi y trivalentes
GRUPOS AUXOCROMOS
ALUMBRE HEMATOXILINA
Alumbre potasio/aluminio H. HARRIS
Alumbre potasio / amoniaco H. MAYER
Alumbre amoniacal H. DELAFIELD
Alumbre potasio / amoniaco

H. EHRLICH
AUXOCROMOS= ALUMBRES
HEMALUMBRE


pH -3 rojo
pH 1-5 amarilla
pH +6 azul violcea
ALUMBRE
ALUMINIO/POTASIO

Requiere de que en el colorante
coexistan un grupo fenlico y
carboxlico en posicin orto,
desplaza molcula de agua y
forma la laca.
FORMACION LACA
Existira una atraccin electroesttica,
pero los complejos lacados son estables
formacin de enlaces covalentes, que se
genera entre el catin + aniones del tejido
= laca/quelato

Catin cromo y fierro mas estable que
aluminio.
FORMACION LACA
Tincin Nuclear
Grupos fosfricos
Histonas
Lacas de
Hematoxilina
Arginina
Lisina
Hematoxilina
no lacada


ACIDIFICANDO


Retarda sobre oxidacin
Selectividad de la tincin
Acido actico glacial despus de filtrar
Colorante: Hematoxilina
Solvente: etanol
Hematoxilina
Alumbre en agua
Calentar hasta ebullicin.
Mezclar
Mordiente
Sacar del calor.
Agregar con precaucin Ox. Rojo de
mercurio
Oxidante
Antes de usar, filtrar y agregar cido actico
glacial
Acido
HEMATOXILINA HARRIS
Hematena + iones Al = HEMALUMBRE.
El Al +3 tiene afinidad por el DNA
Progresivos o regresivos
Diferenciacin se realiza con
soluciones cidas
Hematoxilinas Alumnicas:
Azulamiento
Hemalumbre rojizo pH cidos
Azulamiento lento
pH agua corriente?
Lavados en
agua
corriente
Agua carbonatada
Borax
Soluciones
alcalinas
H. Frricas
Alumbre de fierro.
Ms resistentes a soluciones cidas.
Progresivas o regresivas
Colorante natural Cochinillas hembras
Molcula compleja
Tie como carmalumbre las mismas
estructuras que las lacas de hematena.
Carmn 1% acuoso en alumbre amoniacal.
Diferenciacin con agua.
Tiempos de tincin 1 a 24 horas.
CARMIN
Uso en coloraciones tricrmicas

Fucsina bsica CI 42510 1% en agua
destilada
FUCSINAS
Menos especficos
Principalmente derivados Xantnicos
Colorantes Citoplasmaticos
Colorante cido lo que le permite
enlazarse con constituyentes celulares de
carga positiva:

Citoplasma
Colgeno
Fibras musculares


Eosina
Coloracin Eosina





+++ +++ +++

TEJIDO
HISTIDINA LISINA ARGININA
Soluciones acuosas o alcohlicas
Eosinfilos o acidfilos
XANTENICOS: EOSINA
EOSINA B
EOSINA Y
Clasificacin
Ortocromticos
Metacromticos
Clasificacin
Carga global aninicos.
Colorantes
cidos
Carga global catinica. +
Colorantes
bsicos
No son bsicos ni cidos, colorean por un
mecanismo diferente. Ej. Impregnaciones
Colorantes
indiferentes
Mezcla de colorantes cidos y bsicos con
carga neutra. Ej Giemsa
Colorantes
Neutros
Color Index
Eosin Y (yellowish eosin): acid red 87, bromoacid J,
bromoacid S, bromoacid siguientes nombres alternativos:
Rojo cido 87, bromocido J, bromocido S, bromocido
CI: nmero nico. Sociedad de Tintereros y coloristas
Siempre incluir el CI ej. Eosina Y CI 45380
Bibliografa
1. Theory and practice of Histological Techniques.
Bancroft 2008
2. Tcnicas en histologa y biologa celular Luis
Montuenga Badia
3. Manual de Laboratorio Clnico Diagnstico Raimundo
Garca del Moral 2000
4. Histological and Histochemical Methods Theory and
Practice Kiernan 4 edicin
5. Histotechnology A Self- Instructional Text Carson 3
edicin