MI CROBI OLOGI A GENERAL

Presentado por:

Blga. Jessy Patricia Vsquez Chumbe
UNIDAD I
CRECIMIENTO MICROBIANO
Visin Global del crecimiento
celular
CRECIMIENTO
Se define como el incremento del nmero de clulas.

El crecimiento es un componente esencial de la
funcin microbiana, ya que la clula individual tiene
un tiempo de vida determinado y la especie se
mantiene gracias al crecimiento continuo de la
poblacin celular.

Adems del conocimiento del crecimiento microbiano
el control del crecimiento resulta til para el diseo de
mtodos de control de crecimiento microbiano.
Visin Global del crecimiento
celular
La clula bacteriana es una mquina capaz de duplicarse as
misma. Estos procesos sintticos del crecimiento implican no
menos de 2000 reacciones bioqumicas de varios tipos, como
por ejemplo transformaciones de energa, sntesis de pequeas
molculas (unidades bsicas macromolculas), cofactores,
enzimas necesarias para rxs enzimticas.

Sin embargo, las reacciones principales de sntesis celular son las
reacciones de polimerizacin, aquellas por las que se construyen
polmeros (macromolculas) a partir de monmeros. Ejm ADN,
ARN, protenas.

Una vez fabricados estos, ocurren los acontecimientos finales
del crecimiento celular: ensamblajes de las macromolculas y
formacin de estructuras celulares como pared celular,
membrana citoplasmtica, flagelos, ribosomas, cuerpos de
inclusin, complejos enzimticos, etc.

Fisin Binaria
En la mayora de los procariotas, el crecimiento de
una clula individual contina hasta que se divide en
dos nuevas clulas, proceso denominado fisin
binaria.

En E. coli, se observa que las clulas se alargan hasta
aproximadamente el doble de longitud, desarrollando
un tabique transversal, que eventualmente separa a la
clula en dos clulas hijas.

Este tabique se denomina septo y es el resultado del
crecimiento hacia dentro de la membrana
citoplasmtica y pared celular desde direcciones
opuestas.
Fisin Binaria
Durante el ciclo del crecimiento, todos los constituyentes
celulares incrementan en nmero de tal manera que cada
clula hija recibe un cromosoma completo y copias
suficientes de todas las macromolculas, monmeros e iones
inorgnicos que le permitirn vivir como clula
independiente.

El tiempo requerido en bacterias para completar un ciclo de
crecimiento es muy variable y dependiente de muchos
factores tanto nutricionales como genticos.

Bajo las mejores condiciones Escherichia coli puede
completar su ciclo en unos 20 minutos; otras pueden hacerlo
ms rpidamente, pero muchas le hacen ms lentamente.
Fisin Binaria
Crecimiento de poblaciones
Crecimiento, es el incremento del nmero de clulas en
una poblacin, que tambin puede medirse como un
incremento en la masa microbiana.
La velocidad de crecimiento es el cambio de nmero de
clulas o masa celular por unidad de tiempo. Durante
este ciclo todos los componentes estructurales de la
clula se duplican.
El tiempo requerido para que una clula se divida en dos
se denomina tiempo de generacin. Por tanto, es el
tiempo que requiere una poblacin de clulas para
duplicarse.
Ciclo de crecimiento de poblaciones
En un cultivo continuo o en batch, una curva de
crecimiento tpica puede dividirse en fases:
FASE DE LATENCIA
Cuando una poblacin se inocula en medio fresco, no
ocurre crecimiento inmediatamente, sino despus de
cierto tiempo que se llama fase de latencia.
Si un cultivo en fase exponencial se inocula exactamente
en el mismo medio, no se observa esta fase, sino que
sigue creciendo exponencialmente.
Ciclo de crecimiento de poblaciones
Si el inculo parte de un cultivo viejo, entonces tiene
lugar una fase de adaptacin, incluso si todas las clulas
presentes en el inculo son viables (capaces de
reproducirse). Esto ocurre porque las clulas en estas
condiciones, carecen de determinados componentes
esenciales y tiene que transcurrir un cierto tiempo para
que proceda a su sntesis.
Tambin se requiere una fase de adaptacin cuando las
clulas han sido daadas mediante tratamientos por
calor, radiaciones, txicos, o cuando se transfieren de un
medio rico a uno pobre, etc.

Ciclo de crecimiento de poblaciones
FASE EXPONENCIAL
Es la fase en donde una clula se divide en dos, stas en
otras dos y as sucesivamente.
La mayora de los microorganismos unicelulares crecen
exponencialmente, pero las velocidades de crecimiento
exponencial pueden variar, por influencias de factores
ambientales, as como por las caractersticas genticas del
microorganismo en cuestin.
En general los procariotas crecen ms rpidamente que
los eucariotas, los eucariotas pequeos ms rpido que
los grandes.
Ciclo de crecimiento de poblaciones
FASE ESTACIONARIA
Es imposible mantener el crecimiento exponencialmente
indefinidamente, lo que habitualmente sucede es que, un
nutriente esencial del medio de cultivo se acaba, o algn
producto de desecho se acumula en el medio hasta
alcanzar concentraciones inhibitorias. La poblacin en
estas condiciones alcanza la fase estacionaria.
Es esta fase no hay incremento (o decremento) del
nmero de clulas. Sin embargo, todava ocurren muchas
funciones celulares, incluyendo el metabolismo
energtico y algunos procesos biosintticos.
Ciclo de crecimiento de poblaciones

En algunos microorganismos ocurre un crecimiento lento
durante la fase estacionaria, algunas clulas crecen y
otras mueren, siendo el balance total ausencia de
incremento en el nmero de clulas. Este fenmeno se
conoce como crecimiento crptico.
Escherichia coli, tiene genes que son necesarios para la
supervivencia celular durante la fase estacionaria. Estos
genes denominados sur (por survival=supervivencia)
tienen funciones an desconocidas, pero mutaciones en
estos genes conducen rpidamente a muerte celular a
medida que entran en fase estacionaria.
Ciclo de crecimiento de poblaciones
FASE DE MUERTE
Si la incubacin contina despus que la poblacin
alcance la fase estacionaria, las clulas deben permanecer
vivas y metablicamente activas, pero tambin deben
morir. Si lo ltimo ocurre, se dice que las clulas entran
en fase de muerte.
En algunos casos la muerte va acompaada de lisis
celular.
La fase de muerte es tambin una funcin exponencial,
pero la velocidad con que sucede es mucho ms lenta que
el crecimiento exponencial.
Curva de crecimiento tpica para una
poblacin bacteriana.
Tcnicas de evaluacin de
poblaciones microbianas

El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensin
se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopa,
nmero de colonias), masa celular (peso seco, turbidimetra) o
actividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin al
tamao de la poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en dos
apartados:
a) Mtodos directos
- Recuento del nmero de clulas en una cmara Thoma
- Peso seco celular
- Determinacin de nitrgeno o de protenas totales
- Determinacin de DNA
Tcnicas de evaluacin de
poblaciones microbianas
b) Mtodos indirectos:

- Recuento de colonias en placa
- Recuento sobre filtro de membrana
- Consumo de oxgeno
- Liberacin de dixido de carbono
- Concentracin de un enzima constitutivo
- Decoloracin de un colorante
- Incorporacin de precursores radiactivos
- Medida de la turbidez
Recuento total de clulas
El nmero de clulas de una poblacin puede medirse directamente
al microscopio.

El recuento en muestras lquidas requieren cmaras especiales de
recuento, que tienen en su superficie una rejilla sobre la cul se
coloca un volumen conocido de muestra. El nmero de clulas por
unidad de rea de la rejilla se cuenta directamente en el
microscopio, lo que nos da un nmero de clulas por unidad de
volumen. Convertir este valor a nmero de clulas por mililitro de
suspensin se hace fcilmente: el valor obtenido por un valor de
conversin.

El recuento microscpico directo es una manera rpida de estimar
el nmero de clulas microbianas, sin embargo tiene una serie de
limitaciones:

Recuento total de clulas
1. Las clulas muertas no se distinguen de las vivas.
2. Las clulas pequeas son difciles de ver al microscopio y
algunas de ellas probablemente no se cuentan.
3. Se requiere tiempo y habilidad para conseguir precisin
por este mtodo.
4. Requiere un microscopio de contraste de fases cuando la
muestra no es teida.
5. Este mtodo no es bueno para una suspensin de clulas
poca densa. En caso de bacterias si la suspensin tiene
menos de 10
6
clulas/ml se vern pocas clulas en campo
del microscopio. Se puede mejorar el recuento
concentrando por centrifugacin en un pequeo volumen.
Recuento microscpico
directo utilizando la
cmara de Petroff-
Hauser.
Recuento en Hemacitmetro,
cmara de Neubauer o Retculo
de Thoma.
El cuadrado central tiene un
volumen de 0.1 mm
3
. El nmero
de clulas del cuadrado central
por 10 dar el n de clulas en 1,0
mm
3
. Este nmero multiplicado
por 1000 nos dar por 1,0 cm
3
o
1,0 ml de cultivo. Si se han
contado solo 5 cuadrados de la
parte central, el recuento debe
multiplicarse por 5 x 10
4
para
obtener el recuento por ml.
Recuento de viables
Se utiliza cuando se quiere contar solo clulas viables.
Se define como clula viable, aquella capaz de dividirse para
dar lugar a descendencia. La forma de contarlo, es
determinando el nmero de clulas capaces de generar
colonias sobre la superficie de un medio slido. Por sta
razn al mtodo se le denomina recuento en placa o
recuento de colonias.
Hay dos maneras de llevar a cabo este recuento: por siembra
en superficie o por vertido en placa. Para la siembra en
superficie se utiliza 0,1 ml de inculo y para el vertido de
0,1 a 1,0 ml.
Diluciones. El nmero de colonias por placa no debe ser
muy elevado para poder contar y por otra parte no debe ser
muy bajo para que el recuento tenga significado estadstico.
Recuento de viables
FUENTES DE ERROR

El nmero de colonias de un recuento de viables depende del
tamao del inculo, del medio de cultivo y la condiciones de
incubacin empleadas.
El recuento de viables puede ser fuente de error muy grandes
de modo que hay que tomar con precaucin y replicar las
placas de las diluciones claves. El resultado se expresa como
UFC en lugar de clulas viables ya que una UFC puede
contener ms de una clula.
A pesar de las dificultades asociadas con el recuento, ste
procedimiento arroja la mejor informacin posible y por tanto
es ampliamente utilizada. En industria de los alimentos,
lecheras, medicina y microbiologa acutica, ste mtodo es
empleado rutinariamente.
Mtodos para realizar un recuento de viables. La muestra debe
ser previamente diluida.
Procedimiento para contar viables utilizando diluciones seriadas de
la muestra. El diluyente puede ser simplemente agua, pero una
solucin balanceada de sales puede dar mejores resultados. El
factor de dilucin es el recproco de la dilucin.
Medidas de masa celular y turbidez
En algunos casos, es necesario estimar la masa de clulas
presente en el cultivo ms que el nmero de clulas.

Debido a que la masa celular es proporcional al nmero se
puede utilizar la determinacin de un parmetro para
estimar el otro.

Se puede medir la masa celular neta por centrifugacin de
un volumen conocido y simplemente pesar el precipitado.

El procedimiento habitual es determinar el peso seco
despus de secar las muestras durante una noche a 90-
110C. La masa seca de las clulas bacterianas es
aproximadamente entre el 10 al 20% de la masa hmeda.
Medidas de masa celular y turbidez
Un mtodo ms rpido y til, para obtener una estimacin del nmero
de clulas o biomasa, consiste en la utilizacin de medidas de
turbidez.

Una suspensin celular aparece turbia porque las clulas dispersan la
luz que atraviesa la suspensin. Cuntas ms clulas haya ms luz se
dispersa y ms turbia aparece la suspensin.

La turbidez puede medirse con un fotmetro o un espectrofotmetro,
aparatos que hacen pasar la luz a travs de una suspensin celular y
detectan la cantidad de luz no dispersada.(a)

La mayor diferencia entre estos dos instrumentos es que el fotmetro
emplea un filtro simple (normalmente rojo, verde o azul) para generar
luz incidente de una amplitud de onda relativamente ancha, mientras
que el espectrofotmetro emplea un prisma o red de difraccin para
generar luz incidente de banda estrecha.
Medidas de masa celular y turbidez
Sin embargo ambos miden solamente luz no dispersada
expresando los resultados en unidades fotomtricas. Ejm.
Unidades de densidad ptica (DO) para espectrofotmetro.(a).

Para organismos unicelulares, las unidades fotomtricas DO
son proporcionales (dentro de ciertos lmites) a la masa
celular y tambin al nmero de clulas. Por tanto las medidas
de turbidez pueden utilizarse como un sustituto para otros
mtodos de recuento.

Sin embargo y antes de utilizar la turbidez como mtodo de
recuento, hay que realizar una curva estndar que relacione
medidas directas (microscpicas o por recuento en placa) con
las indirectas. Tales curvas contienen datos para nmero de
clulas y masa celular, permitiendo la estimacin de ambos
parmetros a partir de una sola medida de la turbidez.
Medidas de masa celular y turbidez
A elevadas concentraciones de clulas, la luz dispersada de la
unidad detectora puede ser rescatada por otra (apareciendo a la
fotoclula como si nunca se hubiese dispersado). Cuando ocurre
esto, la correspondencia uno a uno entre nmero de clulas y
turbidez pierde linealidad. (c).

Sin embargo dentro de ciertos lmites, las medidas de turbidez
pueden ser razonablemente precisas y adems tienen la virtud de
ser rpidas y fciles de tomar.

Adicional a esto, las medidas de turbidez pueden tomarse sin
distorsionar mucho las muestras, por sta razn se emplean
ampliamente para seguir el crecimiento de los cultivos
microbianos. Se pueden medir repetidamente la misma muestra y
construir grficos semilogartmicos para calcular tiempos de
generacin. (b).
Medidas turbidimtricas del crecimiento microbiano.
Las medidas se realizan en espectrofotmetro o fotmetro. La
fotoclula mide la luz incidente no dispersada por las clulas en
suspensin o da las lecturas en densidad ptica o unidades
fotomtricas.
b) Curva de crecimiento tpica representada con datos en unidades Klett para dos
organismos que crecen a velocidades diferentes.
c) Relacin entre el nmero de clulas o peso seco y sus lecturas en turbidimetra.
Ntese que la equivalencia se pierde a valores altos de turbidez.
CINTICA DEL CRECIMIENTO
MICROBIANO
Generalidades
El objetivo de la biotecnologa es obtener productos
metablicos tiles a partir de materiales biolgicos.

La biotecnologa comprende dos fases distintas: fermentacin
y recuperacin de los productos.

Para el cultivo de microorganismos y la produccin de
metabolitos y enzimas a partir de los mismos, deben ser
desarrollados procedimientos de fermentacin.

El procesamiento posterior recupera los productos por
extraccin y purificacin, (separacin, destilacin,
calentamiento, enfriamiento y desecacin, cromatografa,
electroforesis).
Generalidades
En los procesos de fermentacin la ingeniera es solamente una
ayuda en el desarrollo del proceso, el centro de atencin son la
regulacin de los procesos biolgicos y los microorganismos.

La manipulacin gentica, regulacin del metabolismo mediante
optimizacin del medio de cultivo y el suministro adecuado de
oxgeno en condiciones estriles son solamente formas de dirigir
los procesos hacia el producto deseado.

Cuanto ms precisamente se conocen los procesos durante el
crecimiento y formacin del producto, mayor es la posibilidad de
operar los procesos de fermentacin racionalmente en lugar de
hacerlo empricamente.

Generalidades
Se necesita un entendimiento claro de la cintica del
crecimiento microbiano para predecir como va a
evolucionar un cultivo, el consumo de sustrato y la
acumulacin de los productos, cuando se desea manejar
adecuadamente un proceso a gran escala.




Fermentacin discontinua
La fermentacin discontinua (batch) es considerada como un
sistema cerrado.

A un tiempo cero t=0, la solucin esterilizada de nutrientes
se inocula con microorganismos y se permite que se lleve a
cabo la incubacin en condiciones ptimas de fermentacin.
A lo largo de la fermentacin no se aade nada, excepto
oxgeno (aire), agente antiespumante y cidos o bases para
controlar el pH.

La composicin del medio de cultivo, la concentracin de la
biomasa y la concentracin de metabolitos cambia
generalmente en forma continua como resultado del
metabolismo de las clulas. En stas condiciones se observa
las cuatro fases tpicas de crecimiento.
Fermentacin discontinua
En este tipo de fermentacin despus de la incubacin, se
produce un incremento de la biomasa hasta un valor
mximo denominado crecimiento total.

En este proceso se observa un crecimiento celular
propiamente dicho y aumento de clulas por
autoduplicacin. La biomasa es un catalizador de una
reaccin que produce ms biomasa idntica a la de partida.

En la Fig.1, se muestra un experimento de crecimiento
exponencial. Cuando esto se representa en ejes de escala
aritmtica, se obtiene una curva caracterstica en la cul se
va incrementando progresivamente la pendiente. Sin
embargo obtener informacin sobre la velocidad de
crecimiento a partir de este tipo de curva es dficil.

Tiempo (hr) N total clulas
0 1
0.5 2
1 4
1.5 8
2 16
2.5 32
3 64
3.5 128
4 256
4.5 512
5 1 024
5.5 2 048
6 4 096
6.5 8 192
7 16 384
7.5 32 768
8 65 536
8.5 131 076
9 262 144
9.5 524 288
10 1 048 576
Fg.1.-Datos representados en escala
aritmtica (izquierda) y en escala
logartmica (derecha).
Fermentacin discontinua
En la misma fgura se presenta el nmero de clulas en
escala logartmica (base 10) frente al tiempo en escala
aritmtica (grfica semilogartmica) lo que da una lnea
recta.

Los grficos semilogartmicos son convenientes y simples
de usar para la estimacin de tiempos de generacin a partir
de resultados experimentales. El tiempo de generacin
puede leerse directamente a partir del grfico.

Una de las caractersticas del tiempo exponencial es que la
velocidad de incremento en el nmero de clulas es lenta
inicialmente, para despus incrementar constantemente en
una autntica explosin del nmero de clulas, como se
puede apreciar en la Fig. 1.
Fermentacin discontinua
Una implicacin prctica de todo esto es que cuando a un
producto no estril como la leche, se permite condiciones
de crecimiento no controladas, unas pocas horas en fases
tempranas de crecimiento exponencial la carga bacteriana
no tiene relevancia, pero ese mismo tiempo en fases
tardas, tiene consecuencias desastrosas para el mismo.

Clculo de tiempos de generacin
Tiempo de generacin, es el tiempo que tarda un poblacin
en duplicarse. Se puede definir tambin como la cantidad
de tiempo requerida para completar un ciclo de divisin.

Para muchos propsitos, en microbiologa, es til conocer
el tiempo de generacin de una poblacin microbiana
durante el crecimiento exponencial, y se puede obtener de
un anlisis matemtico de los datos del nmero de clulas,
como se indica en la Fig 1 y 2.

Para poder cuantificar el aumento del n de clulas de la
poblacin, es importante limitarnos aqu a microorganismos
que se multiplican por fisin binaria, tal como sucede con
la mayora de bacterias.
Tiempo (hr) N total clulas
0 1
0.5 2
1 4
1.5 8
2 16
2.5 32
3 64
3.5 128
4 256
4.5 512
5 1 024
5.5 2 048
6 4 096
6.5 8 192
7 16 384
7.5 32 768
8 65 536
8.5 131 076
9 262 144
9.5 524 288
10 1 048 576
Fg.1.-Datos representados en escala
aritmtica (izquierda) y en escala
logartmica (derecha).
Fig. 2.- Mtodos de estimacin
de los tiempos de
generacin de 6 y 2
horas respectivamente,
a partir de grficos
semilogartmicos. La
pendiente de cada lnea
es 0,301/g.
Clculo de tiempos de generacin
Si consideramos el crecimiento de una nica clula en
condiciones ambientales que no imponen ninguna restriccin a su
multiplicacin, el crecimiento de dicha clula, que se divide de
forma binaria, sigue una progresin geomtrica de base 2, es
decir:

2
0
2
1
2
2
2
3 .
2
n

Si la poblacin inicial, en vez de estar formada por una clula,
est formada por N
0
clulas, el nmero final de clulas que habr
en un momento dado (N
1
) depender, obviamente, del nmero de
generaciones que hayan tenido lugar (n), y ser:

N
1
= N
0
. 2
n
(1)

Clculo de tiempos de generacin
Si tomamos logaritmos:

log N
1
= log N
0
+ n . log 2 (2)


Conociendo experimentalmente N
0
y N
1
, el nmero de
generaciones n puede determinarse por la ecuacin:

log N
1
- log N
0


n = ________________ (3)
log 2

Como el log 2 es igual a 0,301, puede escribirse tambin:

n = 3,32 ( log N
1
- log N
0
) (4)

Clculo de tiempos de generacin
Estos clculos permiten determinar con facilidad el nmero de
generaciones que han tenido lugar en una poblacin que ha
incrementado su nmero de clulas de N
0
a N
1
. Es importante
resaltar que stas frmulas son vlidas para cualquier organismo
vivo que prolifere por divisin binaria.

El factor que puede introducirse ahora hace referencia al tiempo
necesario para que N
0
clulas se conviertan en N
1
. Este factor si
que es caracterstico de cada microorganismo y puede variar
enormemente de uno a otro. La introduccin del factor tiempo (t)
implica necesariamente la aparicin del concepto de velocidad de
multiplicacin (R), o nmero de generaciones por unidad de
tiempo:
n
R = ------ (5)
t

Clculo de tiempos de generacin
Si el valor de n se obtiene de la ecuacin (4), tenemos:

3,32 (log N
1
- log N
0
)
R = ------------------------------- (6)
t

Un concepto que suele utilizarse para caracterizar el crecimiento
microbiano es el llamado tiempo de generacin g, que es el
tiempo necesario para que se duplique la poblacin:

g = 1/R

g = t / n (7)
Clculo de tiempos de generacin
EJERCICIOS

Calcular el tiempo de generacin con datos de la fgura 1 y 2.


Velocidad de crecimiento
microbiano
El planteamiento matemtico realizado hasta ahora es un modelo
terico, que si bien posibilita una aproximacin interesante para
la determinacin de una serie de parmetros que caracterizan al
crecimiento microbiano, presenta algunas limitaciones. Por ejm.
Hay que tener en cuenta que no todas las clulas de un cultivo se
dividen, por lo que, en conjunto, el cultivo presentar un valor de
g algo mayor que el calculado a partir de la ecuacin (7).

Una aproximacin matemtica ms precisa se basa en considerar
el mismo sistema referido anteriormente, es decir, clulas
creciendo en condiciones no restrictivas, como un sistema
autocataltico y analizar los cambios que se producen en la
biomasa en intervalos de tiempo en lugar de estudiar el promedio
de cambios en el nmero de clulas que tienen lugar a lo largo de
un perodo de tiempo.

Velocidad de crecimiento
microbiano
En estas condiciones, el aumento de biomasa a lo largo del
tiempo es proporcional a la biomasa existente, por lo que
sigue una cintica de una reaccin de primer orden.

En trminos matemticos, esto puede expresarse como:

dN / dt = N ( 8 )

De aqu en adelante, N puede ser cualquier parmetro que
refleje la biomasa, como el nmero de clulas, absorbancia
(DO), cantidad de protenas, cantidad de cidos nucleicos, etc.
Por otro lado, t es el tiempo y es una constante de
proporcionalidad que se denomina constante de la fase de
crecimiento o velocidad especfica de multiplicacin.
Velocidad de crecimiento
microbiano
Si integramos la ecuacin (8) entre N
0
y N
1
, tenemos :

ln (N
1
/ N
0
) = t ( 9 )

Tambin con este planteamiento matemtico puede calcularse
el tiempo de generacin, g, a partir de la ecuacin (9). Si g es
el tiempo necesario para la duplicacin de la poblacin,
tendremos que N
1
= 2N
0
y t= g.
Sustituyendo:

ln 2
ln 2 = . g g = ------- = 0,693/ (10)

Velocidad de crecimiento
microbiano
Si comparamos las ecuaciones (7) y (10):

g = 1/R g = 0,693 /

Entonces:
= 0,693 . R

Otra frmula:
( ln N
1
ln N
0
)
= -----------------------------
(t - t
0
)

Velocidad de crecimiento
microbiano
Con esto se demuestra que existe una correlacin
inversa entre el valor de la tasa de crecimiento y el
tiempo de generacin.

Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el
nmero de clulas, masa celular, etc. despus de un
cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien
poder calcular la tasa de crecimiento a partir de
medidas experimentales del incremento en el nmero
de clulas, biomasa, etc.
Velocidad de crecimiento
microbiano
EJERCICIOS

1. Calcular la velocidad especfica de crecimiento () con los
datos de la Fg. 1.

2. Calcule y g, con los siguientes datos:

Microorganismo: Escherichia coli
Medio de cultivo: TSB
Longitud de onda: 540 nm

Los datos de clculo son las absorciones medidas en un
espectrofotmetro, que se observan en la Tabla N1.


Velocidad de crecimiento
microbiano






Efectuar el clculo del tiempo de generacin y de la velocidad especfica
de crecimiento del microorganismo en el tramo de la fase exponencial.
Tabla N1.- Datos absorbancia
Fig. N3.- Curva de crecimiento
de E. coli.
Velocidad de crecimiento
microbiano
3. Escherichia coli se desarrolla en un medio de cultivo a 37C,
determinndose el peso seco (g/l) a diferentes tiempos como
se muestra en la Tabla N2.
Tiempo
(min)
Peso seco
(g/l)
0 0
30 0.01
60 0.03
90 0.09
120 0.12
150 0.25
180 0.35
210 0.45
240 0.50
300 0.55
330 0.56
Calcule la velocidad especfica de
crecimiento y el tiempo de
generacin.
Velocidad de crecimiento
microbiano
4. Si la concentracin celular al inicio de un cultivo es 10
4

cel/ml y despus de 4 horas se producen 10
8
cel/ml. Calcular
la velocidad especfica de crecimiento y el tiempo de
generacin.

5. Una bacteria tiene un tiempo de duplicacin de 3.5 horas. Si
se inocula con 2 x 106 cel/ml en un fermentador, Cunto de
biomasa se producir despus de 26 horas de fermentacin?

Factores que influyen sobre el
crecimiento microbiano
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO

Otra pregunta interesante es si vara con la concentracin
del sustrato de crecimiento ( [S] ). Si los valores de
obtenidos con diferentes concentraciones de sustrato se
representa grficamente, se obtiene:

En condiciones de sustrato abundante, la concentracin de
este no afecta el valor de , pero cuando el sustrato se hace
limitante, si existe ese efecto. La expresin matemtica que
relaciona ambos parmetros se conoce con el nombre de
ecuacin de Monod.

En sta ecuacin la tasa de crecimiento o velocidad especfica
de crecimiento , depende de la mxima que puede alcanzar
el microorganismo (
m
), de la concentracin de sustrato (S) y
de un valor constante (K
s
).

En la prctica, los valores de K
s
suelen ser muy bajos, lo que
indica que los microorganismos crecen con tasas () muy
prximas a las mximas (
m
) a concentraciones de sustrato
bajas y slo cuando estas son extremadamente bajas, la
velocidad de crecimiento se reduce.
Efecto de la concentracin de sustrato
La curva obtenida es muy parecida a la descrita para la
catlisis enzimtica. Monod demostr que la ecuacin de esta
curva es:
[S]
=
m
. ------------ (11)
K
s
+ [S]
donde
m
es la velocidad especfica mxima de crecimiento
para valores de [S] no muy alejados de aquellos para los que
deja ser limitante para el crecimiento. K
s
es la constante de
saturacin, igual a la concentracin de sustrato que reduce la
velocidad especfica de crecimiento a
m
.

La ecuacin (11) se parece mucho a la ecuacin de Michaelis-
Menten para la cintica de los sistemas enzimticos. De este
modo tambin puede aplicarse el mtodo de Lineweaver-Burk
para la determinacin ms precisa de K
s
y
m
.

Efecto de la concentracin de sustrato
La ecuacin (11) puede expresarse tambin como:


1 K
s
+ [S] 1 K
s
1
--- = ------------- = ---- ---- + --- (12)

m
. [S] [S]
m

m


Llevando a una grfica los valores de 1/ como ordenadas y
los de 1/ [S] como abscisas, puede calcularse la Ks (fig. 4).

Efecto de la concentracin de sustrato
Fig. 4.- Determinacin de la K
s
para un sustrato determinado.
A la hora de establecer una relacin entre la
concentracin de sustrato y la tasa de crecimiento
bacteriana, es muy importante tener en cuenta que las
bacterias incorporan la mayora de nutrientes por
mecanismos de transporte activo o de translocacin de
grupo. Ello implica que incluso cuando un nutriente
est notablemente diluido en el medio, su
concentracin citoplasmtica es mxima. Por ello,
bajas concentraciones de sustrato proporcionan ya una

m
.

Si existe un exceso de todos los sustratos, entonces
=
m
y el cultivo se mantiene en la fase logartmica
a su velocidad mxima de crecimiento.

Efecto de la concentracin de sustrato
Efecto de la concentracin de sustrato
La
m
de un microorganismo es un parmetro cintico
bastante especfico de cada microorganismo, es
necesario su conocimiento e interesante no solo como
una de las pruebas de verificacin de la presencia de
microorganismos invasoras en un proceso de
fermentacin industrial, sino tambin evalua la
importancia de stas levaduras en el proceso. Por
ejemplo, si la
m
de sta levadura fuera bajo, su
eliminacin del proceso sera ms fcil de aquella con

m
prximo al microorganismo responsable de la
fermentacin.

Es importante decir que la comparacin entre las
m
de
varias cepas debe ser realizada en las mismas
condiciones de trabajo.

Factores que influyen sobre el
crecimiento microbiano
RENDIMIENTO DE LOS CULTIVOS

Monod tambin demostr experimentalmente que
existe una relacin constante entre el crecimiento de
un cultivo y la cantidad de sustrato utilizado:

dN/dt = Y dS/dt (13)
Donde Y es el llamado factor de produccin o
rendimiento de utilizacin del sustrato. Durante la fase
exponencial:

Y = peso de biomasa producida (g) / peso de sustrato consumido (g)

Rendimiento de cultivos
Es la cantidad de biomasa producida por
unidad de substrato consumido (Y).

Es muy variable, desde un 20-50% para
bacterias heterotrficas aerobias hasta un 2-4%
para anaerobias (metanobacterias), y refleja la
eficiencia con que se genera ATP a partir de
un substrato.
Este grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc) de un
cultivo a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya
concentracin decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa.
Factores que influyen sobre el
crecimiento microbiano
TEMPERATURA

Cada microorganismo tiene una temperatura de
crecimiento adecuada.

Si consideramos la variacin de la velocidad de
crecimiento en funcin de la temperatura de cultivo,
podemos observar una temperatura mnima por debajo
de la cual no hay crecimiento; temperatura ptima a la
que la velocidad es mxima. Por encima de esta
temperatura, la velocidad de crecimiento decae
bruscamente y se produce la muerte celular.

Temperatura
Cada microorganismo tiene una temperatura de
crecimiento adecuada.

Si consideramos la variacin de la velocidad de
crecimiento en funcin de la temperatura de cultivo,
podemos observar una temperatura mnima por debajo
de la cual no hay crecimiento; temperatura ptima a la
que la velocidad es mxima. Por encima de esta
temperatura, la velocidad de crecimiento decae
bruscamente y se produce la muerte celular.

Temperatura
El aumento de la velocidad de crecimiento con la
temperatura se debe al incremento generalizado de la
velocidad de las reacciones enzimticas con la
temperatura.

La falta de crecimiento a temperaturas bajas se debe a
la reduccin de la velocidad de las reacciones
bioqumicas y a la formacin de cristales impidiendo el
funcionamiento de la membrana celular.

La muerte celular a altas temperaturas se debe a la
desnaturalizacin de protenas y a las alteraciones
producidas en las membranas lipdicas a esas
temperaturas.

Temperatura
Es importante tener en cuenta que a
temperaturas bajas, el metabolismo celular es
lento y las clulas paran de crecer; aunque
suelen morir. Sin embargo, cuando la
temperatura es superior a la ptima, se produce
la muerte celular rpidamente y las clulas no
pueden recuperar su capacidad de divisin si
baja posteriormente la temperatura. Esto permite
esterilizar por calor y no por fro.

Tipo de
microorganismo

Temperatura
mnima

Temperatura
ptima

Temperatura
mxima

Mesfilo

5 - 15

30 - 45

35 47

Psicrfilo

-5 + 5

12 - 15

15 20

Psicrtrofo

-5 + 5

25 - 30

30 35

Termfilo

40 - 45

55 - 75

60 - 90
pH
Es un parmetro crtico en el crecimiento de
microorganismos ya que cada uno de ellos tiene
un rango de pH en el que puede vivir
adecuadamente.

En general, las bacterias crecen con mayor
rapidez a pH comprendido entre 6,0 y 8,0; las
levaduras entre 4,5 y 6,0 y los hongos
filamentosos entre 3,5 y 4,0.
pH

La capacidad del pH bajo para limitar el crecimiento
microbiano, ha sido aprovechada deliberadamente desde
los tiempos ms antiguos en la conservacin de alimentos,
con la adicin de los cidos acticos y lctico.

En los alimentos con pH menores a 4.0, no se produce
crecimiento de microorganismos patgenos o indicadores
de contaminacin fecal tales como, Salmonella spp.,
Escherichia, coli, Staphylococcus coagulasa positiva,
Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Vibrio
cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, entre
otros.
pH
Los microorganismos que pueden crecer a pH
menores de 2 se les denomina acidfilos y los
que crecen por arriba de 10 alcalfilos.


Nutrientes
Muchos microorganismos son capaces de
utilizar de los alimentos los nutrientes y la
energa que requieren para su desarrollo y en
dependencia de los nutrientes que tenga un
alimento en particular, ste se considerar de
mayor o menor riesgo.

Los nutrientes utilizados son el carbohidrato,
nitrgenos, lpidos, factores de crecimiento.








Conclusiones factores que afectan el
crecimiento microbiano
Los factores que influyen en el crecimiento
microbiano en los alimentos y por tanto las
asociaciones que se desarrollan, tambin
determinan la naturaleza de una alteracin en ellos
y cualquier riesgo para la salud.
La longitud de la fase de latencia de crecimiento
puede alargarse, si se controlan estos factores de
crecimiento.
Tambin hay que tener en cuenta que para la
conservacin de los alimentos se realiza una
combinacin de factores .
Potencial Redox
El potencial redox indica las relaciones de oxgeno
entre los microorganismos y es utilizado para
especificar el ambiente en que un microorganismo
es capaz de generar energa y sintetizar nuevas
clulas.

Los microorganismos aerobios necesitan para
crecer valores redox positivos (presencia de
oxgeno), mientras que los anaerobios requieren
valores redox negativos (ausencia de oxgeno).
Potencial Redox
La mayora de los microorganismos importantes
para la salud pblica en los alimentos, son
facultativos, pueden crecer en presencia y
ausencia de oxgeno.

Una forma de reducir el crecimiento microbiano
es controlando la atmsfera de los alimentos,
creando condiciones de anaerobiosis.
Actividad de agua
Es el agua que se encuentra en los alimentos y
no est ligada al soluto.

La mayora de los microorganismos y
especialmente las bacterias se desarrollan a Aw
cercanas a 1 (0.993-0.998).

A valores inferiores de Aw, la velocidad de
crecimiento disminuye y la fase de latencia
aumenta, conservndose mejor los alimentos.

Actividad de agua
Entre las prcticas ms frecuentes que ha
empleado el hombre para alargar la vida til de
un alimento se encuentra la deshidratacin, como
es el proceso de salazonados (utilizando sal como
soluto para eliminar el agua de los alimentos,
tales como carnes, pescados).

Tambin se han utilizado azcares para aumentar
la presin osmtica del producto, este es el caso
de los dulces en almbar, las mermeladas, las
conservas de guayabas, mangos, etc.
Actividad de agua
Los alimentos se pueden clasifican en funcin de
su Aw en perecederos (tienen una vida til corta
y requieren refrigeracin para detener la
proliferacin microbiana; semiperecederos,
(tienen una vida til un poco ms larga que los
perecederos), y no perecederos (pueden
conservarse a temperatura ambiente).