Curso: Microbiologa Aplicada a la

Nutricin
Semana 4
Estudio de bacterias
(coloraciones y medios de cultivo)
Seccin: 1MN41
Blgo. Giancarlo Ubills Celi
Nutricin y Diettica I Ciclo
Son un grupo diverso de microorganismos
unicelulares, procariotas, que se pueden
encontrar prcticamente en cualquier
ambiente (suelos, aguas, aire, y como
simbiontes, parsitos, o patgenos del hombre,
otros animales y plantas.
Son los organismos ms pequeos que
contienen toda la maquinaria requerida para su
crecimiento y autorreplicacin a expensas del
material alimenticio.
LAS BACTERIAS
La mayora de las bacterias tienen un rango
de tamao que va de 0,2 a 1,2 m de
dimetro y de 0,4 a 14 m de longitud.
3
Blgo. Yury Cruzado Torres - Microbiologa y
Parasitologa
Forma y ordenamiento de las Bacterias
La forma de las bacterias no es constante y, a menudo, una misma especie adopta
distintos tipos morfolgicos, es lo que se conoce como pleomorfismo. Existen tres tipos
fundamentales de bacterias:
Los cocos o formas esfricas:
En grupo de dos: Diplococos
En cadena: Estreptococos
Agrupaciones irregulares
(racimos): Estafilococos
En forma de bastoncillo, son los bacilos
Formas helicoidales:
espiroquetas
espirilos
vibrios

A: Bacilo
B: Estreptococo
C: Estafilococo
D: Diplococo
E: Espirilo
F: Bacilo en forma de coma (Vibrio)
Morfologa y Estructura bacteriana
Las bacterias son microorganismos Procariotas de organizacin muy sencilla. La clula
bacteriana consta de:

Citoplasma: Presenta un aspecto viscoso, y en su zona central aparece un Nucleoide que
contiene la mayor parte del ADN bacteriano. En algunas bacterias aparecen fragmentos
circulares de ADN con informacin gentica , dispersos por el citoplasma: son los
Plsmidos.

La membrana plasmtica presenta invaginaciones, que son los mesosomas, donde se
encuentran enzimas que intervienen en la formacin de la molcula energtica (ATP), y
los pigmentos fotosintticos en el caso de bacterias fotosintticas.
En el citoplasma tambin se encuentran inclusiones de diversa naturaleza qumica. Por
ejemplo:

Grnulos de volutina o grnulos metacromticos que son de polifosfato. Se tien de color
prpura con azul de metileno y se usan para identificar ciertas bacterias.
Glbulos de Azufre, sirven de reserva de energa para aquellas bacterias que oxidan el
sulfuro de hidrgeno.

Poseen ARN y ribosomas caractersticos, los cuales realizan la sntesis de protenas.
En ciertas bacterias se pueden reconocer dos tipos de apndices superficiales:
1. flagelos que son rganos de
locomocin. La disposicin de los
flagelos sobre la superficie de la
bacteria difiere en las distintas
especies y constituye un carcter
taxonmico importante.
Clasificacin de
las bacterias
segn la
disposicin de
los flagelos.

2. pili (Latn: cabellos), conocidos tambin como fimbriae (Latn : flecos). muy
numerosos y cortos. Se has descrito dos tipos de pili:
pili comunes: son filamentos rgidos, cortos y numerosos 100 a 200 por bacteria;
tienen capacidad de adherencia al ltex, glbulos rojos y epitelios, entre otros.
pili sexuales: a diferencia de los pili comunes son largos, flexibles y poco
numerosos, de 1 a 4 por bacteria. Son los encargados de la transferencia del
material gentico (ADN) de una clula a otra, en el proceso de apareamiento
bacteriano llamado conjugacin (Reproduccin Parasexual).
Algunas bacterias tienen la facultad de producir un cuerpo oval de pared gruesa que
corresponde a una clula de alta resistencia llamada Esporo, segn su localizacin en la
clula pueden ser:
Exoesporos: se localizan externamente a la clula, como en el genero Estreptomyces.
Endoesporos: se encuentran dentro de la clula ubicndose en diferentes posiciones y
son producidos por los generos Bacillus, Clostridium y Sporosarcinas. Estas presentan
las siguientes propiedades:
No presentan actividad
metablica
Gran resistencia al efecto
del calor
Gran resistencia al efecto
de las radiaciones
Gran resistencia al efecto
de los productos qumicos
La Capsula , presente en algunas bacterias, es una capa mucosa, viscosa que varia de
espesor, protege a las bacterias que la poseen de la fagocitosis, lo cual favorece su
multiplicacin y facilita la invasin del organismo infectado
LA PARED CELULAR BACTERIANA
es una estructura rgida que mantiene la forma caracterstica de cada clula
bacteriana. Dependiendo de las especies y de las condiciones de cultivo, la
pared celular puede suponer desde el 10% al 40% del peso seco de la clula
PEDTIDOGLUCANOS
N-
acetilglucosamina
(NAG)
Pptido de 4
aminoacidos
. Acido N-
acetilmurmic
o (NAM)
las paredes celulares no son
estructuras homogneas sino que
poseen distintas capas que varan
segn el tipo de bacteria,
existiendo diferencias tanto en su
grosor como composicin. Estas
diferencias se utilizan para
identificar y clasificar las bacterias,
as como diferenciarlas mediante
la tincin de Gram.
La pared celular de las bacterias
Gram (-) es ms delgada que la de
las Gram (+). Tanto las bacterias
Gram (+) como las Gram (-) poseen
un heteropolmero conocido como
peptidoglucano o murena.
Pared celular de las bacterias Gram (+): Contiene una sola capa compuesta de
peptidoglucano y cidos teicoicos que son polmeros de glicerol o ribitol fosfatos
que se unen al peptidoglucano o a la membrana citoplasmtica
Pared celular de las bacterias Gram (-): Contiene dos capas, una membrana externa y una
capa de peptidoglucano.

El espacio que existe entre la membrana citoplasmtica y la membrana externa se
denomina espacio periplsmico. La capa caracterstica de las Gram (-) es la membrana
externa que acta como barrera selectiva al paso de algunas sustancias. Su estructura
bsica es una bicapa lipdica que contiene fosfolpidos (capa interna), lipopolisacridos y
protenas (capa externa). Esta bicapa est unida al peptidoglucano a travs de
lipoprotenas. De todos estos componentes, los lipopolisacridos (LPS) son caractersticos
de las bacterias Gram (-) y slo se encuentran en la membrana externa.
Coloraciones Bacterianas y
Medios de Cultivo
Fundamento

Las bacterias deben
ser sometidas a la
accin de colorantes
con la finalidad de
visualizarlas y poner
en evidencia sus
componentes
estructurales tales
como flagelos,
cpsula, etc.

Estructura general de una bacteria
Coloraciones

Las coloraciones son
tcnicas que permiten
observar
microorganismos en
funcin de la
capacidad de los
mismos para retener
(o no), determinadas
sustancias colorantes,
lo que depende de la
carga de la clula y del
colorante.
Colorantes

Los colorantes pueden ser de
distintos tipos:
Catinicos : sustancias que
tienen carga positiva. Penetran
en el interior de las clulas y las
tien. Ejemplos: Azul de
metileno, Cristal violeta,
Safranina.
Aninicos : Con carga negativa,
no penetran en el interior de la
clula, de modo que no tien
las clulas sino el entorno. En
este caso se habla de tincin
negativa. Ejemplos: Eosina
Liposolubles: se mezclan con
los lpidos celulares y los tien.
Ejemplo: sudn.

Colorantes
De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se
pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son:
Simples : Utilizan un solo colorante. Las clulas presentan una
composicin qumica diferente a la de su entorno, de modo que ambos se
comportan de forma distinta frente a un colorante . El colorante tie las
clulas como en el caso de : Azul de metileno
Diferenciales : Los diferentes tipos de clulas presentan distinta
composicin qumica y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a
una tincin, lo que permite clasificar a los microorganismos en diferentes
grupos, segn su capacidad de tincin. Ejemplos: tincin de Gram y Ziehl-
Neelsen, ambas utilizan ms de un colorante.
Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composicin
qumica de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes.
Ejemplos: tincin de esporas, de flagelos, de paredes celulares, etc.
Pueden utilizar uno o ms colorantes
Coloracin Azul de
Metileno



Es una coloracin simple
que permite observar
presencia o ausencia de
microorganismos y distinguir
algunas formas bacterianas :
cocos, bacilos , espirilos.
Es un buen colorante simple
que acta sobre todas las
clulas bacterianas
rpidamente y que no
produce un color tan intenso
que oscurezca los detalles
celulares.
Tincin Ziehl-Neelsen

Es una tcnica de tincin
diferencial rpida y
econmica, para la
identificacin de
microorganismos patgenos,
por ejemplo
M. tuberculosis
Fue descrita por primera vez
por dos mdicos alemanes,
Franz Ziehl (1859-1926), un
bacterilogo y Friedrich
Neelsen (1854-1894), un
patlogo.

Fundamento


Las paredes celulares de ciertas
bacterias contienen cidos
grasos de cadena larga que les
confieren la propiedad de
resistir la decoloracn con
alcohol-cido, despus de la
tincin con colorantes bsicos.
Esta tcnica requiere
calentamiento para que el
colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras.
Al suspender el calentamiento y
enfriar con agua, provoca una
nueva solidificacin de lo cidos
grasos de modo que el
colorante ya no puede salir de
las bacterias.
Tincin Gram


Tcnica descrita por el
bacterilogo dans Christian
Gram en 1884.
El colorante es a base de
cristal violeta.
Este colorante se combina
con ciertos cidos orgnicos
complejos que se ubican en
la pared celular.
La porcin rgida de la pared
est formada por
peptidoglucano el cual se
encuentra en proporciones
elevadas en las bacterias
Gram positivas y en menor
proporcin en las Gram
negativas.
Bacterias Gram positivas
Son aquellas que se tien de azul
oscuro o violeta por la tincin de
Gram.

La envoltura celular de las bacterias
Gram-positivas comprende la
membrana citoplasmtica y una pared
celular compuesta por una gruesa
capa de peptidoglucano.
La capa de peptidoglucano confiere
una gran resistencia a estas bacterias y
es la responsable de retener el tinte
durante la tincin de Gram.

Incluyen especies tanto mviles (va
flagelos) como inmviles con forma de
bacilo (Bacillus, Clostridium,
Corynebacterium, Lactobacillus,
Listeria) o coco (Staphylococcus,
Streptococcus); con gruesas paredes
celulares o sin ellas (Mycoplasma).

Bacterias Gram negativas

En microbiologa, se denominan
bacterias Gram negativas a aquellas
bacterias que NO se tien de azul
oscuro o violeta por la tincin de
Gram, y lo hacen de un color rosado
tenue. Esta caracterstica est
ntimamente ligada a la estructura de
la envoltura celular, por lo que refleja
un tipo natural de organizacin
bacteriana.
Las bacterias Gram negativas
presentan dos membranas lipdicas
entre las que se localiza una fina pared
celular de peptidoglucano.
Al ser la pared fina, no retiene el
colorante durante la tincin de Gram.

Medios de cultivo


Son fuentes nutritivas,
naturales o sintticas,
que semejan al nicho
ecolgico de los
microorganismos, en el
cual se desarrollan.
Fundamento
Cada individuo tiene su
propio ambiente y
forma de vida, y para
cultivar a los
microorganismos, se les
somete a un ambiente
parecido donde haya
alimentos, temperatura,
presin atmosfrica y
presin osmtica
adecuados.
Condiciones generales
Presentar todos los elementos necesarios, en
sus proporciones y/o cantidades necesarias.
pH adecuado
Condiciones osmticas adecuadas
Estril y preservado de cualquier
contaminacin.
Medio fresco ya que se desecan y pierden
humedad, concentrndose el resto de los
componentes.
Componentes de los medios de cultivo
Agua : destilada
Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un
polisacrido que se obtiene de ciertas algas marinas.
Las bacterias no son capaces de degradarlo.
Azcares : son una fuente de carbono para los
microorganismos. Los ms empleados son : glucosa,
lactosa y sacarosa.
Extractos : son preparados de ciertos rganos o tejidos
animales o vegetales, obtenidos con agua y calor.
Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de malta.
Componentes
Peptonas : son protenas hidrolizadas , se obtienen por
digestin qumica o enzimtica de protenas animales o
vegetales.
Fluidos corporales : sangre completa, plasma o suero
sanguneo, son aadidos a los medios empleados para
el cultivo de algunos microorganismos patgenos.
Sistemas amortiguadores : son sales que se aaden al
medio para mantener el pH dentro del rango ptimo
del crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos
bisdicos
Indicadores de pH : son indicadores cido-base que se
aaden para detectar cambios de pH en el medio.
Principales tipos de medios de
cultivo
Por su origen
Naturales: donde no
hay mucha
modificacin; por
ejemplo leche, papa.
Artificiales o sintticos:
Donde ha habido
modificacin por
medios qumicos. Por
ejemplo agar nutritivo,
agar Mac Conkey
Por su consistencia
Lquidos: son soluciones
acuosas. Ej. Caldo
nutritivo
Slidos: Son los medios
lquidos a los que se les
ha agregado agar-agar,
gelatina para
endurecerlos. Ej. Agar
nutritivo
Semislidos: Para
estudios de motilidad
Por su funcin o fines especiales
Medios nutritivos
(simples)



Con nutrientes
mnimos para que las
bacterias poco
exigentes desarrollen .
Ejemplo: caldo y agar
Nutritivo.
Medios nutritivos
enriquecidos

Son medios simples a
los que se aaden
ciertos productos a
manera de
suplemento nutritivo
que permiten el
aporte de factores de
crecimiento. Ejemplo:
agar Sangre, agar
Chocolate
Medios de
enriquecimiento

Son medios lquidos
que por su
composicin qumica
favorecen o permiten
la multiplicacin de
unos
microorganismos,
inhibiendo
parcialmente la de
otros. Ejemplo: caldo
Selenito, caldo
Peptonado alcalino.
Medios selectivos

Permiten el crecimiento
slo de la especie que se
desea aislar, para lo cual
se les agrega colorantes
bacteriostticos: Azul de
metileno, Verde
malaquita, Verde
brillante. Ejemplos: agar
Mac Conkey, agar
Salmonella-Shigella (SS),
agar Manitol salado

Medios diferenciales

Contienen sustancias
nutritivas y un
indicador de pH que
permite detectar las
reacciones
bioqumicas
especficas de los
microorganismos.
Ejemplo: agar Triple
azcar (TSI),agar rea,
agar Citrato de
Simmons.
Medios de transporte

Permite mantener
viables a los
microorganismos
durante el traslado
al laboratorio.
Ejemplo: caldo
Hafna, Cary Blair,
Stuard.
Aislamiento y cultivo de
bacterias
Aislamiento de colonias
Una colonia es un grupo de
clulas bacterianas con
caractersticas
morfolgicas propias, que
se hallan en un medio
slido o semislido.
Una colonia aislada
presenta una forma,
consistencia y color
particulares, pudiendo
adquirir diversas
tonalidades ajenas a su
naturaleza ntima por
accin de los colorantes
que suelen llevar los
medios de cultivo.
Clases de Siembra
Por estra
Con un asa de siembra se toma una
muestra de la poblacin y a
continuacin se hacen estras sobre la
superficie de un medio slido
preparado en una placa Petri.
Conforme se van haciendo estras en
zigzag con el asa, cada vez se van
depositando en la superficie del medio
menos microorganismos.
A continuacin, se flamea el asa, se
toca en la regin donde se han
realizado las ltimas estras y se
contina la siembra con la misma
tcnica, en la superficie de medio sin
sembrar an. Repitiendo este proceso
varias veces se logra separar clulas
individuales.
Por agotamiento
En este caso se inocula la
segunda placa con el
cultivo de la primera y se
realiza siembra por
agotamiento, es decir se
realizan estras sucesivas
hasta agotar el inoculo.
Sirve para cultivos muy
concentrados. A partir de
la ltima estra podremos
contar las colonias.
Por diseminacin
Consiste en sembrar sobre
la superficie del medio de
cultivo slido,
generalmente en placa
petri, donde el desarrollo
debe ser homogneo a
manera de monocapa, la
siembra se realiza
extendiendo el inoculo por
todo el medio con ayuda
de un rastrillo de vidrio.

Siembra en puntada