TRABAJO FINAL

OBTENCIN DE
DEXTRANO
Integrantes :
Caceda Lara, Liliana
Flores Olivares , Diana
Introduccion
Toda la produccin industrial de este biopolmero se realiza a
partir de mtodos biotecnolgicos, mediante dos vas de
Fermentacin, a partir de sacarosa y con la participacin de la
bacteria Leuconostoc mesenteroides B512, principalmente. Se
obtienen as cadenas muy largas (dextranos nativos o crudos),
que posteriormente habr que fragmentar hasta conseguir
tamaos ms adecuados a su aplicacin final, mediante un
proceso de hidrlisis y Sntesis enzimtica: Se hace crecer un
microorganismo que produce la enzima de inters, llamada
dextransacarasa. Cuando se tiene la cantidad deseada, se
adiciona sacarosa al medio y dicha enzima produce la
polimerizacin a dextrano.

DEXTRANO


Polisacrido de alto peso
molecular

Estructura: D-glucosa unidos por
EG alfa (1,6)

Son diversos estructuralmente
Generalmente se producen por
Streptococcus, Acetobacter y
Leuconostoc en medios con
sacarosa
el dextrano es un polisacrido complejo y
ramificado formado por numerosas
molculas de glucosa; unidades en
cadenas de longitud variable (de 10 a 150
kilodaltons). La cadena consiste en
uniones glucosdicas 1->6 entre
molculas de glucosa, mientras que las
ramificaciones empiezan en uniones 1->4
(en algunos casos tambin en uniones 1-
>2 y 1->3).
Cepa.
Muchos Organismos producen Dextranos, pero solo el
Leuconostoc Mesenteroides y el L. Dextranicum
(Lactobacteriaceae) Son utilizados para la
produccin,comercialmente.



Fuente : Benchmark ( 2002),








I.REACCIONES QUE INTERVIENEN EN LA SINTESISDE
DEXTRANO

Figura 2. Reacciones que intervienen en la formacin del dextrn.
Segn Gonzales (1985), en la industria alimentaria se utilizan para
preparar dulces que posean una textura interior adecuada, mientras
que la industria de la pintura, los teres y steres mixtos de dextranos
son usados como agentes lacantes. Adems, determinadas columnas
cromatogrficas cuentan con dextranos como fase fija.
Su campo de aplicacin ms importante es, sin duda, la medicina:
Se utilizan disoluciones de dextranos como sustitutos del
plasma sanguneo, ya que sus propiedades osmticas y reolgicas son
similares. Su aplicacin en este sentido es cada vez menor, y se
considera ms conveniente la del dextrano al 3,5 % para
hemodiluciones teraputicas reolgicas.
La sal sdica del ster del cido sulfrico y dextrano (complejo
dextrano-sulfato) tiene propiedades anticoagulantes similares a la
heparina.
Pueden formar complejos con el hierro, con lo que pueden ser
usados para el tratamiento de anemias ferropnicas cuando es
inviable la administracin oral de sumplementos.
La versatilidad del dextrano viene dada por sus propiedades:
es neutro y soluble en agua, fcilmente filtrable, biocompatible,
biodegradable y estable durante ms de cinco aos.
:
IV. MEDIO DE CULTIVO
K
2
HPO
4
0,6 g
- KH
2
PO
4
0,6 g
- NH
4
Cl 3 g
- MgSO
4
0,1 g
- CaCl
2
0,02 g
- Glucosa 25 g
- Acetto sdico 20 g
- Aminocidos (ala, arg, asn asp,cis, glu, gln, gly, his, iso, leu, lis, met, phe, pro, ser, thr, trp, tyr, val).
100-200 g de cada uno
- Purinas y pirimidinas (adenina, guanina, uracilo, xantina).
10 mg de cada una
Vitaminas (biotina, folato, cido nicotnico, piridoxal, piridoxamina, piridoxina, riboflavina, tiamina, 0,01-
1 mg de cada una
Elementos traza 2-10 g
(Fe, Co, Mn, Zn,
Cu, Ni, Mo)
Agua destilada 1000 ml
pH7
V. PRODUCCION DE DEXTRANO A NIVEL
INDUSTRIAL.
La sntesis de dextrano se realiza por
fermentacin bacteriana o enzimtica. El
microorganismo empleado es Leuconostoc
mesenteroides de las cepas NRRL B-512F, 512 y
B1299; slo con la cepa B-512F se produce
dextrano a escala industrial, a partir de
sacarosa comercial, Gonzales (1985). El
sustrato ms comnmente empleado es la
sacarosa en concentraciones aproximadas de
5%; y en fermentacin enzimtica puede ser
hasta ms o menos 20% y se obtiene una
concentracin de dextrano de 20 g/L.
Figura 2. Diagrama del pretratamiento realizado a los residuos de
cscaras de naranja, pial cachaza.
Fuente: Rodrguez y Henry Hanssen (2007)

PROCESO BIOTECNOLOGICO PARA LA
OBTENCION DE DEXTRANO
CEPA LIOFILIZADA DE
Leuconostoc mesenteroides
NRRL B512
ACTIVACIN DE LA BACTERIA
LEUCONOSTOC
posteriormente resuspendida y
conservada en una solucin de
glicerol al 20% a -20 C

PREINCULO
10 ml de caldo LM
esterilizado

INOCULO
Segunda etapa
de
multiplicacin
en fermentador
subcultivos en tubos
Eppendorf (1,5 mL)
Cultivos: incubados en
matraces

Existen tres etapas
ETAPA DE PROPAGACIN
SINTESIS ENZIMATICA DEL DEXTRAN
RECUPERACION DEL DEXTRAN
La produccin de dextrn consta de tres etapas principales. La primera es la
propagacin del microorganismo, a partir de una cepa pura, en el laboratorio y
su propagacin posterior en la planta, hasta obtener una cantidad suficiente que
permita tener una elevada concentracin de la enzima dextransucrasa
generada por l.
1.1.1. ACTIVACION
La cepa puede ser suministrada por un Instituto como Biotecnologa (IBT,
Morelos). Donde es liofilizada y posteriormente resuspendida y conservada
en una solucin de glicerol al 20% a -20 C. Luego de la activacin, se realiza
subcultivos en tubos Eppendorf (1,5 mL), que dan origen a los pre inculos.
El crecimiento es monitoreado mediante el mtodo de peso seco.

El medio estndar para su activacin y mantenimiento present la siguiente
composicin.
(medio LM): glucosa (2%), extracto de levadura(20 g/L), K2HPO4 (20 g/L),
MgSO4 .7H2O (0,2 g/L),CaCl2.2H2O (0,05 g/L), FeSO4 (0,01 g/L),
MnSO4.7H2O(0,01 g/L), NaCl (0,01 g/L) (Mungua Canales, IBT,envo
electrnico, 2005).
a. Condicin del proceso
El pH del medio se ajusta a 6,7 con H3PO4 y NaOH (0,1 N).
Los cultivos se incuban en matraces a 27 C en condiciones aerobias
agitador orbital a una velocida dde 150 r. p. m.
tiempo : 24 horas

1.1.1. PRE- INOCULO
se prepara previamente un preinculo en caldo LM, el cual se esteriliza a 15
psig durante 15 minutos; esta preparacin consiste en tomar dos asadas
de una suspensin de clulas incubadas a 27 C por 24 horas y aadirlas al
preinculo consistente en 10 mL de caldo LM estril
a. Condiciones del proceso
incubando a 30 C
18-20 horas.
Velocidad de 100 rpm
1.1.2. INCULO
Se prepara el inculo con el sustrato previamente tratado y pasteurizado
correspondiente a cada montaje. La inoculacin se realiza a partir de 5 mL
de preinculo
a. Condiciones del proceso se incuba a una temperatura :
30C aproximadamente, agitacin de 150 r. p. m.
tiempo de 12-18 horas, verificando el crecimiento celular este
valor depende de todos los factores del proceso.
Rodrguez y Hanssen (2007) en las pruebas que hicieron, de
acuerdo con lo arrojado en la fase pre-experimental, el perodo de
incubacin del inculo fue de 12 horas, tiempo en el cual el cultivo
se encuentran la parte final de la fase exponencial de crecimiento
correspondiente a una concentracin de clulas de105 unidades
formadoras de colonia (UFC)/mL. Estevalor se fij para facilitar la
reproducibilidad de los ensayos.

1. SINTESIS ENZIMATICA DEL DEXTRAN
En la segunda etapa se realiza la sntesis enzimtica del dextrn
en una solucin de sacarosa que contiene, adems, extracto de
levadura, una fuente de fosfato como tampn, trazas de sales de
algunos metales como Magnesio, Manganeso, Hierro e Hidrxido
de Sodio para neutralizar el exceso de cido formado durante la
fermentacin.

2.RECUPERACION DEL DEXTRAN
La tercera etapa contempla la recuperacin del dextran por medio
de una precipitacin en alcohol etlico, lavado, reprecipitacin,
disolucin, secado, molinado y envasado.


Figura 5: sntesis enzimtica y recuperacin del dextrano
Fuente: (Bogdan 1997)

BIORREACTOR
Biorreactores son los tanques donde los sistemas, procesos y
organismos vivos llevan a cabo las transformaciones de la
materia prima en productos de valor comercial . Los
biorreactores deben dar , por lo tanto , las condiciones optimas
para que tales conversiones se realicen con sus mximas tasas,
sin duda alguna, se entiende el rol central que juega el
biorreactor para que las industrias biotecnolgicas sean exitosas.
(Byong H.Lee ,1996)


Esquema de un fermentador tipo
tanque agitado de escala industrial
H ~ 15 m de alto
D ~ 4,2 m de dimetro
Tiene lneas de vapor para realizar
la esterilizacin in situ de las
vlvulas, caeras y sellos. Se debe
esterilizar tambin el aire que
ingresa por filtracin o por
calentamiento.

PURIFICACIN DE DEXTRANO
Baudrit . V. 2012.El jugo del desecho de pia inoculado se incub por
18 horas a 29 C, sin agitacin.
Al finalizar el perodo de incubacin se centrifug por 30 minutos a
5000 rpm, para eliminar las clulas.
Al sobrenadante se descart y al precipitado blanco se le agreg
agua hasta disolverlo, para iniciar el proceso de purificacin.
Se centrifuga de nuevo en las mismas condiciones y al sobrenadante
se le agrega etanol (1/1 volumen). El dextrano obtenido se seca.
Factores que influyen pH del
medio
Rodrguez, O (2007) reporto que el valor de pH inicial del medio arroj buenos
resultados cerca de la neutralidad (6,5-7,0), similar a lo reportado con los medios a
base de sacarosa comercial, donde el valor ptimo de crecimiento celular se
encuentra en 6,9 la mayor produccin de polmero sobre cada sustrato fue en
promedio de 0,575 g/L ajustando el medio en un valor de 6,7.
Factores que influyen
temperatura del medio
Rodrguez, O (2007) reporto que a una temperatura de 25 C se
lograba una concentracin promedio de polmero de 0,666 g/L
y una concentracin celular de 3,2 g/L. Es recomendable
trabajar dentro de la zona ptima de crecimiento de L.
mesenteroides (20-30 C).
Factores que influyen
Concentracin del sustrato
Rodrguez, O (2007) .En cuanto a la concentracin de
sustrato en el medio, se obtuvo con cada sustrato un
valor promedio de 0,402 g/L de polmero a una
concentracin de 30 g/L.
Se seleccionaron niveles entre la concentracin mnima
requerida por el microorganismo de acuerdo con la fase
preliminar, ya que, aunque existi produccin de
dextrano en baja concentracin, el crecimiento celular
observado fue muy pobre, lo que se corrobor Salou.P
(1994) y Smith.M (1998) .
La concentracin mxima fue la de cada sustrato, para
aprovechar sus propiedades. Los niveles y variables
seleccionadas segn los resultados obtenidos en esta
etapa se describen en la tabla 2 .

Cuadro . Diseo Experimental

Fuente : Rodrguez, O (2007). OBTENCIN DE DEXTRANO Y FRUCTOSA,
UTILIZANDO RESIDUOS AGROINDUSTRIALES CON LA CEPA Leuconostoc
mesenteroides NRRL B512-F
Produccin de dextranos
Proceso Convencional
Se inicio durante la segunda Guerra Mundial.
La produccin de dextrano se incremento considerablemente .
Fracciones de peso molecular de alrededor de 75000 en
soluciones al 6% han sido empleadas como sustitutos de plasma
en transfusiones sanguneas (dextrano-clinico).
Con una concentracin de 100 g/l es posible obtener 25 g/l de
dextrano .

Produccin de dextranos
Proceso Convencional
El pH inicialmente de 7 disminuye por accin del acido lctico
producido hasta alcanzar valores inferiores a 5.0 al final del proceso .
El proceso dura unas 16 horas y la temperatura se mantiene entre 26-
29C .
Terminado el proceso la dextrano es precipitado con metanol o
etanol, previa eliminacin de clulas.

Produccin de dextranos
Proceso Convencional
Si se desea prepara dextrano clinica , se redisuelve al 5-6 % y se
hidroliza con HCL o H
2
SO
4
(pH =1) en condiciones de
temperatura y tiempo controlados para obtener el peso
molecular deseado .
Empleando una precipitacin fraccionada , es posible obtener
dextrano clnico con rendimientos del 38-40% con respecto a la
dextrano nativa (Garibay.G,2004)
BIBLIOGRAFIA
Byong H.1996.Fundamentos de la Biotecnologa de Alimentos.
Baudrit.V.2012 . Biosntesis de dextranos de alto peso molecular
mediante la inoculacin con Leuconostoc mesenteroides, var.
mesenteroides (ATCC 10830) de jugos residuales de la
agroindustria de la pia: sntesis y caracterizacin de hierro-
dextranos.Rev.Uruguay.
Rodrguez, O .2007. OBTENCIN DE DEXTRANO Y FRUCTOSA,
UTILIZANDO RESIDUOS AGROINDUSTRIALES CON LA
CEPA Leuconostoc mesenteroides NRRL B512-F.Rev.N
7.Colombia.
Garibay .G.2004.Biotecnologa Alimentaria.Editorial
Limusa.Mexico.

GRACIAS!!!!!!!! .