Universidad Central del

Ecuador

Facultad de Ciencias
Qumicas

Qumica A. Cuantitativa 2

HPLC


HPLC Cromatografa lquido de alta resolucin
Encuadra dentro de la
cromatografa de elucin.

Un lquido circula en ntimo
contacto con un slido u otro
lquido inmiscible, al
introducir una mezcla de
substancias en la corriente de
la fase mvil.

Terminado el recorrido de la
muestra por la columna, cada
substancia introducida en el
sistema eluir con tiempo
diferente.
INSTRUMENTACIN
Reservorio Detector
Columna
Inyector
Bomba
Uniones
Tuberas
Reservorio
Uniones
Tuberas
Contiene la fase
mvil
Reservorio-bomba
Bomba-inyector
Inyecto-columna
Columna-detector
Detector-d. en serie
Tuberas-otros
componentes
Puede emplearse
cualquier frasco de
laboratorio
(vidrio o
polmeros)
Acero inoxidable o
polimricas
Dimetro:
Externo, estndar 1/6plg
Interno, muestra-fino
No muestra-grueso
Unin de dos piezas
de acople perfecto
Hembra y macho
- Inerte con fase mvil y
muestra.
- Cerrar hermticamente
- No contribuir al
ensanchamiento de
banda extracolumnar.
Longitud
Un pistn, dos pistones, tres
pistones, bomba tndem y a
diafragma
Bomba
Reservorio-inyector-columna
Varan caudal entregado por
dos mecanismos:
Recorrido y velocidad de
pistn
Volumen de la cmara
del pistn 35-400 l
-Permite cambio de
solvente
La bomba impulsa la fase mvil en
ciclos alternados, causando
caudales discontinuos
Caractersticas:
Caudal. 0,1 y 10,0 ml/min y presiones de 6000psi (408,26)
Exactitud de caudal. Divergencia entre caudal de trabajo
establecido y el real entregado.
Ruido. Variaciones denominadas pulsaciones.
Deriva. Cambio del solvente entregado en periodos largos.
Sistema de corte.
Bombas reciprocantes
Caudal de trabajo variable.
l/min ml/min
Bombas jeringa
Vlvula de
entrada
Pistn
Vlvula de
salida
Atenuadores de pulso
Engranajes no
circulares
Dos o ms pistones de
funcionamiento
sincrnico
Introduccin de la
muestra se lleva en
dos etapas:
Inyector
Permite caudal continuo
del solvente
2. Giro de la
vlvula
1. A presin
atmosfrica
Caractersticas:
- Fcil de operar
- Inerte
- Preciso
- No diluciones
Inyector de vlvulas
Columna
En elle se da la
separacin
Caractersticas de la columna que influyen sobre su capacidad de
separacin: Dimetro interno, longitud, conexiones, relleno y tamao
de la partcula
Las ms utilizadas, las
de relleno
Relleno
Filtro
Tubo 1/6plg
Dimetro 2-60mm
Longitud 5-30cm
Columnas microbore
Dimetro 2-05nm
Longitud 25-100
Cambio en alguna propiedad
fsica de la fase mvil
Detectores
Permite ver y ubicar en tiempo y espacio la
posicin de cada componente
Caractersticas:
Tener un amplio rango dinmica de respuesta
Poseer una repuesta lineal
No contribuir al ensanchamiento de banda
extracolumnar
Responder a todo los solutos
Tener la sensibilidad apropiada
No afectarse por cambios de temperatura
Poseer una buena relacin seal/ruido
No destruir la muestra
Tener una constante de tiempo baja
Detectores
generales
Detectores
selectivos
Detector
electroqumico
Detector de
fluorescencia
Detector UV
D. De ndice de
refraccin
Detector de onda variable
o espectrofotomtrico
Interfermetro
Deflexin
Fresnel
Propiedad propia
del soluto
Detector de onda fija o
fotomtrico
Particin
Adsorcin
BASES DE LA SEPARACIN
Intercambio inica
Exclusin molecular
SOLVENTES
Propiedades de los solventes
Alto poder solubilizante en las muestras
Baja reactividad
Compatibilidad con el detector utilizado
Baja viscosidad
Seguridad
Alto grado de pureza

Desgasificacin de solventes
El Oxgeno Disuelto.- puede producir mayor
interferencia en los detectores de fluorescencia y
electroqumicos.
El Nitrgeno Disuelto .- puede producir burbujas en
la columna de HPLC y cuando el solvente entra al
detector produce picos falsos y desviaciones de la
lnea base.
El Dixido de Carbono disuelto.- Puede ser la causa
de los cambios de pH en el sistema de solvente.

Mtodos de Desgasificacin de
Solventes en HPLC
Sonificacion
Burbujear helio
Desgasificacin electrnica en la
lnea de flujo
Desgasificacin al vacio en la lnea
Elucin
En cromatografa de lquidos es posible
trabajar en dos modalidades:
Isocrtica.- La fase mvil mantiene la misma
composicin durante la elucin.
Gradiente.- Modifica gradualmente la
composicin de la fase mvil durante la
cromatografa.
Influencia de la fase mvil en la
separacin
CROMATOGRAFAS
Cromatografa de Fase Normal
Cromatografa de Intercambio Inico
Cromatografa de Exclusin Molecular
Cromatografa en Fase Normal
NP-HPLC
Polaridad
media alta
Alta actividad
de material
de relleno
Ismeros posicionales
Inconveniente
Fase
estacionaria
Polar
Slice
Almina
Fase mvil
No polar
Mezcla de
solventes
Slice
Alto poder de
adsorcin
60-300A
Alumina
100-200A
Modificadores
Presencia de grupos silanol
Agua
Menor variacin en la retencin de los analitos entre muestra
y muestra.
Aumento sustancial en la capacidad de carga de la columna
Mayor eficiencia
Reduccin de la tendencia del adsorbente a catalizar las
reacciones de los analitos durante la separacin.
Cromatografa de Intercambio Inico
Fase estacionaria contiene los grupos funcionales inicos y
retiene al soluto
Intercambio aninico
Intercambio catinica
Utilizado para la separacin de iones inorgnicos
Especies ionizables son cidos y bases dbiles
Materiales de relleno
Intercambiadores
Aninico
Grupo ionognico
Acido
Catinicos
Ionognico
Bsicos
Mayor difusin
fuertes
Clasificacin :
Polmeros orgnicos
Intercambiadores de fase ligada
xidos inorgnicos
Intercambiadores peculiares
Fase mvil
Acuosa
pH y fuerza inica controlados
Variables en la cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de Exclusin Molecular
Separacin por dimensin molecular
Picos angostos
Tiempos de separacin cortos
Elucin predecible
No hay perdida de muestra
No hay desactivacin de la columna
Mecanismo de separacin
Exclusin molecular
Fase estacionaria
Geles Semirrgidos
Geles Blandos
Las columnas de Exclusin tiene una longitud de 25 a 30cm de
longitud y 0,4 hasta 0.8cm dimetro
Fase Mvil
Preparacin de las muestras
1. Seleccin del mtodo
Propiedades fsicas
Concentracin analito en la muestra


Preparacin de las muestras
Forma de presentacin del analito
Tipo de detector

Tratamiento previo
Depende tipo de muestra
Liofilizacin y Evaporacin
Filtracin y centrifugacin



Desproteinizacin
Utilizando solventes orgnicos(precipitacin)
Ultrafiltracin

Extraccin liquido solido
Solubilizacion de la muestra solida
Extraccin liquido-liquido
Equilibrio entre lquidos inamisibles
APLICACIONES DEL
HPLC
Campos de Aplicacin de HPLC
Frmacos: Antibiticos,
sedantes esteroides,
analgsicos
Bioqumica: Aminocidos,
protenas, carbohidratos,
lpidos
Productos de alimentacin:
Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos
Productos de la industria
qumica: Aromticos
condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles,
Pesticidas, herbicidas, PCB
Qumica forense: Drogas,
venenos, alcohol en sangre,
narcticos
Medicina clnica: cidos
biliares, metabolitos de drogas,
extractos de orina, estrgenos.
El anlisis de medicamentos constituye la aplicacin mas grande
de la Cromatografa HPLC que nos sirve para determinar los
componentes activos de diferentes productos usados en la
industria farmacutica como por ejemplo en las tabletas
analgsicas
La disponibilidad de los patrones analticos es un aspecto crtico en los
mtodos para el anlisis cuantitativo de las antocianinas en desarrollo. Las
antocianinas cianidina-3-O-glucsido y cianidina-3-O-rutinsido se aislaron a
partir de muestras de acai liofilizado que es un fruto de la palma conocida
redondo y prpura en Brasil,
Condiciones de HPLC
La cromatografa se realiz en una columna Waters

La columna utilizada fue

una columna (150 mm x 4,6; 3,5 micras). La fase mvil consisti en 10% de
cido frmico acuoso (disolvente A) y metanol (disolvente B). Se program La
vlvula de seleccin para cambiar a canalizar una al principio de la elucin
cianidina-3-O-glucsido (a 16,2 minutos) y volver a descargar posicin despus
de su elucin parcial (en 18,4 minutos). El mismo procedimiento se realiz con
cianidina-3-O-rutenoside, pero en este momento se ha programado la vlvula
de seleccin para cambiar al canal dos en 21,4 minutos y volver a descargar
posicin en 22,9 minutos. El procedimiento de recogida se realiz con 30
inyecciones del extracto.
Para determinar la concentracin de las antocianinas en cada caso, se compar el rea del pico de la muestra
con el rea del pico del estndar externo, reportando en mg (100 g de muestra)1
GRACIAS..