TCNICAS LABORATORIAIS

PARA DIAGNSTICO DE
COCCDEOS
Alexandre J. Silva
CDC/Atlanta/GA/USA

Aula ministrada em Julho de 2002
ltima atualizao em Novembro de 2006
PRINCPIOS BSICOS:
a) Amostras fecais mltiplas (ao menos 3)* devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretao de diagnstico negativa.
b) Para maximizar a recuperao de oocistos, amostras fecais devem ser concentradas antes do exame microscpico (por exemplo,
centrifugao a 500 X g, 10 min, por mtodo da formalina-acetato de etila). Amostras a serem processadas pelo teste imunoenzimtico no devem
ser concentradas, pois antgenos se perdero durante o procedimento!
c) A escolha das tcnicas diagnsticas depende da disponibilidade de equipamentos e reagentes, experincia e consideraes quanto
a tempo e custo dos exames. Os mtodos mais freqentemente usados incluem:
1. TESTE DE ANTICORPO FLUORESCENTE DIRETO (Imunofluorescncia = IF):
Oocistos (4-6 m) adquirem fluorescncia verde-ma. Esta tcnica oferece a mais alta combinao de sensibilidade e especicidade e
considerada o padro ouro por muitos laboratrios. Entretanto, ela no proporciona um registro permanente como o faz a lmina
corada que pode ser arquivada, alm de requerer equipamento especial (microscpio fluorescente) e a compra de reagentes
comercialmente disponveis.



2. TESTE IMUNOENZIMTICO (ELISA):
As amostas no devem ser concentradas antes de serem testadas. Antgenos de Cryptosporidium so detectados nas fezes por este
mtodo (Amostras positivas prximas ao limiar de reatividade precisam ser confirmadas por IF). O ELISA no depende de prtica
em microscopia, tem elevada sensibilidade e especificidade, e util em levantamentos com grande nmero de amostras em curto
espao de tempo. Entretanto, ele exige equipamento especial (Leitor de microplacas) e aquisio de reagentes comercialmente
disponveis.



3. COLORAO DE KINYOUN (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA):
Oocistos (4-6 m) frequentemente se apresentam com sua parede evidente e se coram de rosa claro a vermelho brilhante. Entretanto,
a colorao pode ser varivel: infeces em fase de recuperao, em particular, podem ter oocistos fantasmas no corados.
Oocistos maduros podem ter esporozoitas visveis (at 4). Este mtodo o mais fcil e prtico e proporciona obteno de registro
permanente. Erros de diagnstico podem acontecer, todavia, em decorrncia da variabilidade nas coloraes e confuso com
artefatos.*O conceito de uso de multiplas amostras de fezes est atualmente sobre reviso. Alguns estudos tem mostrado que a primeira amostra suficiente para
proporcionar diagnsticos precisos em 90% dos casos.
CRYPTOSPORIDIUM
PONTOS CHAVES PARA O DIAGNSTICO LABORATORIAL I
Esfregao de fezes contendo oocistos de Cryptosporidium parvum
corados pela tcnica de Kinyoun (lcool-cido-resistente
modificado)
Oocistos de Crryptosporidium parvum (seta) e cistos de Giardia
intestinalis ( direita) corados com anticorpos fluorescentes.

4. COLORAO PELA SAFRANINA:
Oocistos de Cryptosporidium freqentemente (mas no sempre) adquirem uma colorao vermelho-alaranjada brilhante. Este
mtodo, recomendado para Cyclospora, no muito usado para Cryptosporidium, pois os oocistos de Cryptosporidium nem sempre
se coram.



5. MONTAGEM A FRESCO:
Em microscpio de campo claro, oocistos aparecem como pequenas estruturas arredondadas (4 - 6 m) semelhantes a leveduras.
Eles no apresentam autofluorescncia. Este mtodo menos til para Cryptosporidium que para Cyclospora, especialmente quando
pequeno nmeros de oocistos podem ser confundidos por outros elementos fecais.

6. COLORAO PELO TRICRMIO (ou tricromo):
Oocistos aparecem como pequenas estruturas redondas medindo de 4 a 6 m. A colorao pelo tricrmio uma tcnica de colorao
permanente de rotina para amostras de fezes na maioria dos laboratiros, e os tcnicos devem estar familiarizados com a aparncia
do Cryptosporidium corado com tricromo. Este mtodo de colorao , entretanto, inadequado para diagnstico definitivo, pois os
oocistos aparecero no corados, dificultando o estudo morfolgico. O mtodo de Kinyoun (lcool-cido-resistente modificado) um
mtodo de colorao facil e o mais prtico para realizao de um diagnstico acurado.

DIFERECIAO ENTRE OOCISTOS DE CYCLOSPORA vs CRYPTOSPORIDIUM
Tamanho: Cyclospora 8-10 m; Cryptosporidium 4-6 m.
Esporozotas: no visveis no interior de oocistos de Cyclospora, podem sre discernveis nos oocistos de
Cryptosporidium
Autofluorescncia: presente no Cyclospora, ausente no Cryptosporidium.
Teste de Anticorpo Fluorescente Direto: disponvel para Cryptosporidium.
Teste Imunoenzimtico (ELISA): disponvel para Cryptosporidium.
CRYPTOSPORIDIUM
PONTOS CHAVES PARA DIAGNSTICO LABORATORIAL II
Esfregao de fezes contendo oocistos de Cryptosporidium parvum
corados pela tcnica de colorao pela safranina.
Princpios bsicos:
a) Amostras fecais mltiplas (ao menos 3)* devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretao de diagnstico negativa.
b) Para maximizar a recuperao de oocistos, amostras fecais devem ser concentradas antes do um exame microscpico (por exemplo,
centrifugao a 500 X g, 10 min, por mtodo da formalina-acetato de etila).
c) A escolha das tcnicas diagnsticas depende da disponibilidade de equipamentos e reagentes, experincia e consideraes quanto a
tempo e custo dos exames. Os mtodos mais freqentemente usados incluem:

1. Montagem a fresco:
Sob microscopia de campo claro (contraste de fase ou DIC=differential interference contrast), oocistos se apresentam como esferas
refringentes (8-10 m), com uma parede distinta. Entretanto, outros objetos podem apresentar caractersticas semelhantes.
Sob microscopia de fluorescncia-UV, a parede do oocisto adquire autofluorescncia. Uma intensa fluorescncia azul observada
utilizando-se conjunto de filtros de excitao UV na faixa de 330-365 nm. Se este conjunto de filtros no for disponvel, uma fluorescncia
verde de menor intensidade pode ser observada com filtro de excitao azul (450-490 nm). Outros abjetos podem, entretanto, adquirir
autofluorescncia tambm.



A utilizao de microscpio com ambos os tipos de iluminao, campo claro e de fluorescncia UV, constitui procedimento de diagnstico
eficiente e confiavel, quando presena de objetos autofluorescentes podem ser conferidos por observao em campo claro (e vice versa).
Entretanto, isto requer um microscpio de fluorescncia e no fornece um registro permanente como proporcionaria a lmina corada que
pode ser arquivada.



2. COLORAO DE KINYOUN (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA):
Um fundo azul-esverdeado da preparao fecal permite que os oocistos se sobressaiam. Estes se coram de forma varivel: alguns se
tingiro de rosa claro a prpura intensa, enquanto outros podem no ficar corados.. Os oocistos (8-10 m) podem no ser perfeitamente
redondos; alguns podem se apresentar em colapso ou distorcidos em um dos lados.
* O conceito quanto ao uso de amostras fecais mltiplas est atualmente sobre reviso. Alguns estudos tem demonstrado que a primeira amostra suficiente para
proporcionar diagnstico preciso em 90% dos casos.
CYCLOSPORA
PONTOS CHAVES PARA O DIAGNSTICO LABORATORIAL I

Esfregao de fezes contendo oocistos de Cyclospora
cayetanensis corados pela tcnica de Ziehl-Neelsen
modificada (lcool-cido-resistncia modificada).
Scale bar = 10 m
Scale bar = 10 m
COLORAO DE KINYOUN (CONTINUAO): Eles podem conter grnulos e/ou ter parede de oocisto com aparncia enrugada
(caractersticas que distinguem oocistos de artefatos de colorao). Este mtodo de colorao o mais fcil, e o mais prtico, e permite
um registro permanente. Alm disso, as lminas no precisam ser examinadas dentro de um perodo de tempo rgido e ficam disponveis
para arquivamento. Entretanto, erros de diagnstico podem ocorrer em decorrncia da variabilidade nas coloraes e confuso com
artefatos.
3. COLORAO PELA SAFRANINA:
Oocistos se coram uniformemente em vermelho a vermelho-alaranjado. Esta colorao uniforme diminui o risco de erros de diagnstico.
Entretanto esta tcnica requer aquecimento, e portanto equipamento adicional necessrio (ex: forno de microondas).



4. COLORAO PELO TRICRMIO (ou tricromo):
(Oocistos podem ser detectados, mas no podem ser confirmados por este mtodo)
Oocistos aparecem como esferas (8-10 m) claras, arredondadas e ligeiramente enrugadas. A colorao pelo tricrmio o mtodo de
colorao permanente na rotina da maioria dos laboratrios, e os tcnicos devem estar familiarizados com a aparncia da Cyclospora
corada com tricromo para que os oocistos possam ser detectados nos exames de rotina. Este mtodo de colorao , entretanto,
inadequado para diagnstico definitivo, pois os oocistos aparecero no corados, dificultando o estudo morfolgico. Vale lembrar que os
oocistos se coram de forma varivel pela tcnica de Kinyoun e mais uniformemente pelo mtodo da safranina. As tcnicas de diagnstico
acima referidas devem ser usadas para confirmao de Cyclospora quando este organismo suspeito no corante tricromo.

DIFERENCIAO ENTRE OOCISTOS DE CYCLOSPORA vs CRYPTOSPORIDIUM
Tamanho: Cyclospora 8-10 m; Cryptosporidium 4-6 m.
Esporozotas: no visveis no interior de oocistos de Cyclospora; podem ser discernveis nos oocistos de
Cryptosporidium
Autofluorescncia: presente na Cyclospora, ausente no Cryptosporidium.
Teste de Anticorpo Fluorescente Direto: disponvel para Cryptosporidium.
Teste Imunoenzimtico (ELISA): disponvel para Cryptosporidium.

CYCLOSPORA
PONTOS CHAVES PARA DIAGNSTICO LABORATORIAL II

Esfregao de fezes contendo oocistos de Cyclospora cayetanensis
corados pela tcnica da safranina.

1. MONTAGEM A FRESCO:
Ao microscpio de campo claro, os oocistos so grandes (25 a 30 por 10 a 19 m) e apresentam uma forma elipside tpica (fig. A eB).
Oocistos esporulados (fig. B)podem ser observados se a amostra fecal contendo este coccdeo for armazenado em dicromato de potssio
por mais de dois dias, temperatura ambiente. Oocistos de Isospora belli podem ser visualizados em montagens a fresco, sob
microscopia fluorescente, como ilustrado na fig.C. Uma intensa fluorescncia azul observada utilizando-se conjunto de filtros de
excitao ultravioleta na faixa de 330-365 nm. Se este conjunto de filtros no for disponvel, uma fluorescncia verde de menor intensidade
pode ser observada de excitao azul (450-490 nm). Outros objetos, todavia, podem tambm adquirir fluorescncia.
A utilizao de microscpio com ambos os tipos de iluminao, campo claro e de fluorescncia UV, constitui o procedimento de diagnstico
eficiente e confivel, quando a presena de objetos autofluorescentes podem ser conferidos por observao em campo claro e vice versa.
Entretanto, isto requer um microscpio de fluorescncia e no fornece registro permanente como proporcionaria a lmina corada que pode
ser arquivada.




2. COLORAO DE KINYOUN (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA):
Um fundo azul esverdeado preparao fecal, ou outra colorao contrastante, permite que os oocistos se sobressaiam. Estes se coram de
forma varivel: alguns se tingiro de rosa claro prpura intensa, enquanto outros podem permanecer no corados. Os oocistos (25 a 30
m) tero um formato elipside tpico como mostrado na montagem a fresco, e suas estruturas internas no sero bem visualizadas.
Alguns oocistos podem aparecer em colapso ou distorcidos em um dos lados.
ISOSPORA BELLI
PONTOS CHAVES PARA DIAGNSTICO LABORATORIAL I
Esfregao de fezes contendo um oocisto de Isospora belli corado
pela tcnica de Kinyoun (cool-cido-resistncia modificado).
A B C
PRINCPIOS BSICOS:
a) Amostras fecais mltiplas (ao menos 3)* devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretao de diagnstico
negativo.
b) Para maximizar a recuperao de oocisto, amostras de fezes devem ser concentradas antes de um exame microscpico (por
exemplo, centrifugao a 500 X g, 10 min., por mtodo da formalina-acetato de etila).
c) A escolha da tcnica de diagnstico depende da disponibilidade de equipamentos e reagentes, experincia e consideraes
quanto a tempo e custo dos exames. Os mtodos mais freqentemente usados incluem:
* O conceito quanto ao uso de amostras fecais mltiplas est atualmente sobre reviso. Alguns estudos tm demonstrado que a pri meira amostra geralmente
suficiente para proporcionar diagnstico preciso em 90% dos casos.
ISOSPORA BELLI
PONTOS CHAVES PARA DIAGNSTICO LABORATORIAL II
Esfregao de fezes contendo um oocisto de Isospora belli corado
pela tcnica de safranina.
3. COLORAO PELA SAFRANINA:
Oocistos se coram uniformemente em vermelho a vermelho-alaranjado. Os oocistos (25 30 m) tero formato elipside tpico como na
montagem a fresco e sua estrutura interna pode no estar bem visualizada. Alguns oocistos podem se apresentar em colapso ou
distorcidos em um dos lados. Esta tcnica requer aquecimento, portanto equipamento adicional necessrio (ex: forno microondas).
PONTOS CHAVES PARA IDENTIFICAO DE OOCISTOS DE ISOSPORA BELLI
Tamanho: 25 a 30 por 10 a 19 m.
Esporozotas: podem ser vistos em oocistos maturados fora do corpo.
Autofluorescncia: presente.
Teste de Anticorpo Fluorescente Direto: nenhum.
Teste Imunoenzimtico: nenhum.
Safer Healthier People
COLORAO DE KINYOUN (CONTINUAO): Este mtodo de colorao o mais fcil, e o mais prtico, e proporciona um
registro permanente. Alm disso, as lminas no precisam ser examinadas dentro de um perodo de tempo rgido e ficam
disponveis para arquivamento. Entretanto, erros de diagnstico podem ocorrer em decorrncia da variabilidade de coloraes e
artefatos.
Cyclospora sp., Cryptosporidium sp., and Isospora belli
Oocistos em esfregao de fezes corado por tcnica
de Ziehl-Neelsen modificada:
A -Cryptosporidium parvum;
B - Cyclospora cayetanensis;
C - Isospora belli.
Oocistos em esfregao de fezes corado por
tcnica do azul-de-metilenosafranina:
D -Cryptosporidium parvum;
E - Cyclospora cayetanensis;
F - Isospora belli.
Cyclospora cayetanensis em preparaes a fresco:
A a D - Microscopia de contraste de fase
A - Seqncia mostrando evento de esporulao a partir de um oocoisto
no esporulado ( esquerda) at um oocisto esporulado contendo dois
esporocistos ( direita)
B - Oocisto rompido lliberando um esporocisto
C - Esporocistos liberando esporozotos (dois esporozotos livres podem
ser observados )
D - Oocisto no esporulado
E - Microscopia de epifluorescncia
Safer Healthier People
Cyclospora sp., Cryptosporidium sp., and Isospora belli
Oocistos em esfregao de fezes corado por tcnica de Ziehl-
Neelsen modificada:
A -Cryptosporidium parvum;
B - Cyclospora cayetanensis;
C - Isospora belli.
Oocistos em esfregao de fezes corado por tcnica do
azul-de-metilenosafranina:
D -Cryptosporidium parvum;
E - Cyclospora cayetanensis;
F - Isospora belli.
Safer Healthier People
A
B C
D E F
G H I
Montagem a fresco:

G Cyclospora cayetanensis - seqncia mostrando evento de esporulao a partir de um oocisto
no esporulado ( esquerda) at um oocisto esporulado contendo dois esporocistos ( direita);

H Isospora belli;

I - Microscopia de epifluorescncia.