Mdulo 1 : Bioqumica

Sumrio
Objetivos
Introduo
Metodologia Utilizada
Tratamento de Dados
Resultados e Discusses
Concluso
Simbologia
Referncias bibliogrficas
Objetivos
Prtica 1: Determinar os parmetros cinticos (Km e Vmx.) da
hidrlise da sacarose pela enzima invertase, utilizando o mtodo de
LineweaverBurk, temperatura constante de 30C e a pH constante de
4,5.

Prtica 2: Verificar a influncia do pH sobre o desempenho da enzima
invertase na catlise da reao de hidrlise da sacarose, alm de
determinar o melhor pH para que a reao enzimtica seja favorecida a
temperatura e concentrao constantes.

Prtica 3: Verificar a influncia da temperatura sobre o desempenho da
enzima invertase na reao de hidrlise da sacarose.




Introduo
Prtica 1:
Reaes enzimticas so amplamente utilizadas no
setor industrial;
Enzima um catalisador orgnico que atua sobre
determinado substrato, devido alta especificidade,
promovendo a reao qumica,sendo regenerada ao
trmino desta.
A velocidade da reao pode ser determinada pela
derivada da curva de concentrao do substrato em
funo do tempo inicial, equao (1):

Introduo
(1)

As condies experimentais so bem conhecidas no
incio da reao enzimtica.
Michaelis e Menten (1913) propuseram uma teoria
geral de cintica enzimtica, que segue o esquema:



v
dt
dy
dt
dS
dt
dP
= = =
Introduo
Utilizando da hiptese anterior, pode-se mostrar que o
modelo de Michaelis & Menten expresso pela equao
(2):
(2)
Conforme o modelo, medida que a concentrao do
substrato aumenta, a taxa da reao tende a uma
constante (V
mx
e K
m
) devido saturao da enzima pelo
substrato.


S Km
S Vmx
v
+

=
.
Introduo
O procedimento grfico de Lineweaver-Burk consiste
na linearizao do modelo de Michaelis & Menten,
podendo ser utilizado para determinao dos
parmetros cinticos V
mx
e K
m
de acordo com a equao
(3):
(3)

Reaes biolgicas podem ser monitoradas utilizando
espectrofotmetro, manmetro, polarmetro,
condutivmetro e etc.


.
1 1
.
1
Vmx S Vmx
Km
v
+ =
Introduo
Prtica 2:
Para ocorrer uma catlise cida ou bsica,deve existir uma
enzima cataliticamente ativa em apenas uma forma ionizada.Um
modelo bastante til e simples que representa tal fato vem a
seguir(BAILEY E OLLIS,1986):
E E + H EE + H
Dadas as reaes,temos que:



Onde a frao total de enzima dada por:[Eo]=[E] + [E] + [E]

A frao da enzima ativa(E) dada por:


Introduo
Tal equao apresenta um y mximo tal que:


Portanto:

A funo y diminui simetricamente com a mudana de pH perto de seu
valor timo,fato que tambm pode ser representado pela variao da
velocidade da reao em funo do pH,atravs da seguinte frmula:
Vmx = k*[Eo]*y
Atravs de uma anlise dos valores da velocidade de reao(modelo de
Michaelis-Menten) em funo dos valores de pH,obtm-se os parmetros
K1 e K2 necessrios para avaliar o pHtimo para a atividade enzimtica.

2 1 ] [ K K timo H = +
Introduo
Prtica 3:
A temperatura uma varivel de extremo interesse em
se tratando de reaes enzimticas, visto que a
velocidade e a manuteno da reao so dependentes
de T. Devido ao alto grau de especificidade de cada
enzima, faz-se necessrio o estudo da variao da
velocidade de reao com T e consequentemente a
identificao da temperatura tima de trabalho.
Materiais Utilizados
gua destilada
Bureta
DNS
Invertase
Sacarose
Reator de vidro encamisado
Banho termostatizado
Tubos de Follin-Wu
Suporte para Tubos de Follin-Wu
Bico de Bunsen
Baldes de plstico
Vasilha de alumnio
Proveta
Termmetro
Pipeta graduada de 1 mL
Pipeta automtica ajustada para 0,5 mL
Cronmetro
Espectrofotmetro
Luvas descartveis
Metodologia utilizada
Determinao da curva de calibrao.
Procedimento:
Dispe-se de solues de glicose em diferentes
concentraes conhecidas, provenientes de diluies de
uma soluo me de glicose.
Prepara-se um branco adicionando 0,5 mL de gua
destilada e 1 mL de DNS em um tubo de Follin-Wu.
Retira-se 0,5 mL de cada um dos frascos contendo as
solues de glicose e coloca-se em tubo de Follin-Wu
juntamente com 1 mL de DNS.
Metodologia utilizada
Realiza-se o aquecimento dos tubos durante 5 minutos
e posteriormente resfri-los em gua fria (em mdia de 5
minutos).
Completa-se o contedo dos tubos com gua destilada
at o menisco de 12,5 mL.
Homogeniza-se as solues contidas nos tubos e
realiza-se a leitura da absorbncia em espectrofotmetro
(=540nm).
Observao: No espectrofotmetro a primeira cubeta do
equipamento ser utilizada para o branco.
Metodologia utilizada
Prtica 1:
Analisamos as seguintes amostras:
Solues de sacarose com diferentes concentraes (10, 20, 30, 50,
70 e 90 g/L) com tampo actico com pH=4,5 e T=30C
(Temperatura e pH constante).
Procedimento:
Coloca-se 40 mL de amostra (soluo de sacarose), volume
tomado, juntamente com 1 mL de gua destilada no reator
temperatura de 30C.
Retira-se uma alquota de 0,5 mL da soluo e colocar em tubo de
Follin-Wu, no qual j contm 1 mL de DNS, este procedimento
corresponde ao preparo do branco.
Descarrega-se o reator, realizando a limpeza com gua destilada.
Metodologia utilizada
Novamente coloca-se 40 mL da amostra no reator e, ao atingir a
temperatura de 30C, acrescentar 1 mL de soluo de invertase.
Retira-se 0,5 mL de alquota do reator e transferir para o tubo de
Follin-Wu, no qual adicionamos 1 mL de DNS, em intervalos de
tempo de 3 minutos, por um perodo de 15 minutos.
Colocam-se os tubos em gua em ebulio por 5 minutos.
Resfria-se os mesmos em gua fria (em mdia de 5 minutos) e
depois com gua destilada completar at o menisco correspondente
a 12,5 mL.
Homogeniza-se a amostra e realiza-se a leitura da absorbncia em
espectrofotmetro (=540nm).
Observao: Sempre a primeira cubeta do equipamento ser
utilizada para o branco.


Metodologia Utilizada
Prtica 2:
Utilizou-se solues de sacarose a 50g/L com tampo citrato-
fosfato com pHs de 3;4;4,5;5;6 e 7.
Depois colocou-se 40mL de cada soluo e 1 mL de gua destilada
no reator e esperou-se a temperatura se estabilizar em 30C.
Retirou-se 0,5 mL da soluo e colocou-se em um tubo Follin-Wu
previamente preenchido com 1 mL de DNS, tal soluo
denominada Branco.
Depois de descarregar e limpar devidamente o reator,colocou-se
40 mL da soluo de sacarose e quando a temperatura estabilizou-
se em 30C,acrescentou-se 0,5 mL da enzima invertase. Dado isso,
retirou-se 0,5 mL da soluo e acrescentou-se a um tubo Follin-Wu
j contendo 1 mL de DNS em intervalos de tempo(minutos):
0,3,6,9,12,15. A contagem do tempo partiu da introduo de
invertase no reator.


Metodologia Utilizada
Tais tubos passaram por aquecimento de 5
minutos, posteriormente por resfriamento
temperatura ambiente e foram completados com
gua destilada at 12,5 mL de soluo.
Aps tais procedimentos, fez-se a homogeneizao
da amostra e leitura do branco para obteno das
absorbncias das amostras nos diferentes tempos de
reao em espectrofotmetro. O mesmo processo foi
refeito para as diferentes solues de sacarose com
pHs diferentes.

Metodologia Utilizada
Pratica 3:
Utiliza uma soluo de sacarose (50 g/L
-1
) com tampo
igual ao pH de 4,5.
Ajustamos o banho termostatizado para que o reator
atinja, se possvel, as temperaturas de 20, 25, 30, 40, 50 e
70C.
Colocar 40 mL da amostra (soluo de sacarose) e 1 ml
de gua destilada no reator .
Metodologia Utilizada
Retira uma amostra de 0,5 mL da soluo e colocar em
tubo de Follin-Wu, no qual j existiam 1 mL de DNS
(BRANCO).
Descarregar o reator, promovendo a devida limpeza.
Colocar novamente 40 mL da amostra (soluo de
sacarose) no reator, aguardando que o sistema atinja a
temperatura desejada.
Acrescentar 1 mL de soluo de invertase ao reator.

Metodologia Utilizada
Retirar 0,5 mL de soluo do reator e transferir para
tubo de Follin-Wu, no qual j existiam 1 mL de DNS, em
intervalos de tempo de 3 min, totalizando 15 minutos de
reao).
Colocar os tubos de Follin-Wu em gua em ebulio
por 5 min.
Resfriar em gua fria e depois completar com gua
destilada at 12,5 mL.

Metodologia Utilizada
Homogeneizar a amostra e realizar a leitura do
espectrofotmetro, lembrando sempre de utilizar o
branco.
Efetuar o mesmo procedimento para todas as
temperaturas de reao.

Tratamento dos dados
Dados obtidos para plotar a curva de calibrao.




Tratamento dos dados
Curva de calibrao.







Equao dada pela curva: (4)

y = 4.6585x + 0.0108
R = 0.9962
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
C
o
n
c
.

d
e

g
l
i
c
o
s
e

(
g
/
L
)

Abs. (=540nm)
Curva de calibrao
Curva de calibrao
Linear (Curva de calibrao)
0108 , 0 6585 , 4 + - = x y
Tratamento dos dados
Prtica 1:
Dados experimentais:

Tratamento dos dados
Os valores da absorbncia (Abs.) obtidos
experimentalmente foram divididos por 2.
Os valores de concentrao de glicose (Conc.g/L)
foram obtidos utilizando a equao 4.
Representao grfica da concentrao de glicose em
funo do tempo para as diferentes concentraes de
sacarose.
Tratamento dos dados






Deve-se realizar o mesmo procedimento para as
demais concentraes de sacarose.
Tratamento dos dados
Os grficos fornecem uma equao para os dados
plotados, as equaes devem ser derivadas, segundo a
equao 1.



Plotando os valores de concentrao de sacarose e
velocidade da reao.

Tratamento dos dados






A curva representada pela equao abaixo:

0618 , 0 ) ln( 0334 , 0 = x y (5)
Tratamento dos dados
Aplicado a sitemtica de Lineweaver-Burk.






O grfico acima fornece a seguinte equao:

177 , 12 47 , 344 + - = x y (6)
Tratamento dos dados
Prtica 2:






Atravs dos dados da tabela acima, montou-se grficos da seguinte
natureza para os diferentes pHs:

Tratamento dos dados
y = 0.0487x + 0.0202
R = 0.9999
0.0000
0.1000
0.2000
0.3000
0.4000
0.5000
0.6000
0.7000
0.8000
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0
[glicose](g/L)
tempo(minutos)
pH=7,00
pH=7,00 Linear (pH=7,00)
Tratamento dos dados
Com os y da tabela ao lado,montou-se o grfico
abaixo para a obteno da curva de velocidade
de reao por pH e posterior clculo do pHtimo
experimental para a atividade enzimtica.

Deduzindo o ponto de
mximo da curva por
clculos de derivada,
obteve-se um pHtimo
de 4,34, que
corresponde a uma
velocidade de 0,0959
mol/L*min.

y = -0.0082x
2
+ 0.0713x - 0.0591
R = 0.7283
0.0000
0.0200
0.0400
0.0600
0.0800
0.1000
0.1200
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0
v

(
m
o
l
/
L
*
m
i
n
.
)

pH
Velocidade da reao X pH
Velocidade da reao X
pH
Poly. (Velocidade da
reao X pH)
Tratamento dos dados
Prtica 3:
Dados experimentais:
Tratamento dos dados
Tratamento dos dados
Velocidade da Reao:
Tratamento dos dados
Ajuste de parmetros:
O ajuste segue o modelo de Arrenhius:



Linearizando a equao temos:
36






(

=
RT
E
exp k k
a
0
T
Ln
1
.
R
E
) k ( Ln(k)
a
0
(

+ =
Tratamento dos dados
Ajuste de Parmetros:
Resultados e discusses
Prtica 1:
Os parmetros cinticos Vmx e Km so determinados
utilizando a equao 6.
Comparando a equao 3 com a equao 6, temos que:
Km/Vmx. = 344,47 Km = 28,2886g/L

1/Vmx. = 12,177 Vmx. = 0,0821g/(L * min)


Resultados e discusses
Prtica 2: Atravs dos parmetros K1 e K2
calculados, o pHtimo de 2,42. Observa-se uma
diferena elevada em relao ao pH obtido
experimentalmente que foi de 4,34. Tal fato se
d pela dificuldade de estimar os valores inicias no programa
Statistica,que por sua vez acaba prevendo um valor um pouco diferente do
esperado. A diferena tambm pode ser explicada por possveis erros no
procedimento experimental,fato que afasta ainda mais os resultados
experimental e terico. Com relao ao procedimento, a excluso do pH=5
na curva foi feita para um aumento do parmetro R, que resultou em
uma melhor descrio do comportamento da curva.








Prtica3:
Resultados e discusses
Como resultado temos:
Y = -4088X + 11,13
a = Ln (Ko) = 11,13 Ko = 68186,37
b = [-Ea]/R = -4088 Ea = 33987,6


No grfico de velocidade de reao por temperatura,observa-se um
aumento da velocidade at a temperatura de aproximadamente 50C, esta
que responsvel pela desnaturao da enzima e consequentemente,
reduo acentuada da atividade enzimtica.

Concluso
Os dados apresentados em vermelho no tratamento de
dados so excludos do conjunto de analise, devido a
comportamentos no esperados para os parmetros
estudados neste mdulo. Tal fato ocorre devido a problemas
experimentais, por exemplo: erro humano, equipamentos
contaminados e falta de replicar os pontos coletados.
Os parmetros cinticos de reao so obtidos com uma R
2

baixo, devido a utilizao de poucos pontos, mas observa-se
que o Modelo de Michaelis e Menten aliado a sistemtica de
Lineweaver-Burk descrevem com satisfao a cintica da
reao enzimtica.

Concluso
No estudo da influncia do pH na atividade enzimtica,
apesar da discrepncia dos valores experimental e terico,
conclui-se que o mtodo utilizado satisfatrio,visto que
apenas os erros cometidos no tratamento dos dados devido s
dificuldades matemticas distanciaram os resultados.
O mtodo de anlise da influncia da temperatura na
atividade enzimtica tambm se mostrou bastante
satisfatrio,com R bastante elevados e resultados bem fiis
aos valores esperados.
Simbologia
Km parmetro do modelo Michaelis & Menten [mol.L-3];
Vmx. parmetro do modelo Michaelis & Menten [mol.L-3.T1];
E enzima livre;
S substrato;
ES - complexo enzima-substrato;
P produto;
v taxa de reao [mol.L-3.T-1];
- comprimento de onda;
x Absorbncia;
S substrato;
Simbologia

y - Concentrao de glicose em g/L;
[Eo] - concentrao total da enzima (mol/L);
y - frao da enzima na forma ativada;
k - constante cintica de reao;
[E] - forma ativa da enzima;
[E] e [E] - formas no ativas da enzima;
Referncia bibliogrficas
Determinao da Atividade de Invertase em Extratos
Enzimticos, L.A.M.,Cynthia; A.S.P.,Gustavo; R.,Sueli;
2007.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima.
BAILEY, J. E. & OLLIS, D. F. Biochemical Engineering
Fundamentals.McGraw-Hill Book Company. 2, ed. 1986
983p.