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FLUXO
Aplicaes prticas
Francis Christian da Silva Pereira
PRINCPIOS BSICOS DE
CITOMETRIA DE FLUXO
CITO METRIA FLUXO
Clula Medida Movimento
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
ANTICORPOS MONOCLONAIS
ANTICORPOS MONOCLONAIS
CITMETRO DE FLUXO
CITMETRO DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
SISTEMA TICO
SISTEMA ELETRNICO
SISTEMA FLUIDO: INTRODUZ E ALINHA AS
PARTCULAS EM UM FLUXO CONTNUO
SISTEMA PTICO: GERA E COLETA OS
SINAIS DE LUZ.
SISTEMA ELETRNICO: CONVERTE OS
SINAIS PTICOS EM SINAIS
ELETRNICOS, DISPONIBILIZANDO-OS
PARA ANLISE NO COMPUTADOR.
FOCO DO LASER
CMARA DE FLUXO
SISTEMA FLUIDO
CONVERGNCIA HIDRODINMICA
Low Sample
Pressure
12l/min
Sample
Laminar
Flow
LOW DIFFERENTIAL PRESSURE
Sheath Sheath
Sample
Laminar
Flow
Sheath Sheath
FILTRO DE AR GERA PRESSO AO FLIDO ENVOLVENTE SHEATH
HIGH DIFFERENTIAL PRESSURE
High Sample
Pressure
60l/min
SISTEMA PTICO
SISTEMA COMPOSTO POR UM LASER E LENTES
PARA MOLDAR E ALINHAR O FEIXE DO LASER.
A COLEO DE LENTES SERVE PARA CAPTAR A
DISPERSO E A LUZ FLUORESCENTE EMITIDA
PELAS PARTCULAS QUE INTERAGEM COM O FEIXE
DO LASER.
UM SISTEMA DE ESPELHOS PTICOS E FILTROS
DIRECIONAM OS COMPRIMENTOS DE ONDAS DA
LUZ PARA OS DETECTORES PTICOS ESPECFICOS.
FACSCalibur
FL1
Red Diode Laser
~635 nm
SSC
FL3
FL4
670LP
661/16
585/42
488/10
90/10 Beam Splitter
DM 560SP
Fluorescence
Collection Lens
DM 640LP
Half Mirror
488/10
.
488 nm
Blue Laser
FSC Diode
Focusing
Lens
FL2
530/30
Beam Combiner
Flow
Cell
Flow
Cell
SISTEMA TICO
Filtros pticos coletar sinais de luz
Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu
nmero deixado passar e menor que seu nmero refletido.
Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu
nmero deixado passar e acima de seu nmero refletido.
Espelhos BP (bandpass) = s deixa passar o comprimento de onda
especfico.
SP 500 LP 500
BP500/30
Longpass Shortpass Bandpass
460 500 540 460 500 540 460 500 540
Filtro
Detector clula
fotoeltrica
NGULO DE DISPERSO FRONTAL (FSC)
NGULO DE DISPERSO LATERAL (SSC)
LASER
SISTEMA ELETRNICO
CONVERTE OS SINAIS PTICOS EM
SINAIS ELETRNICOS PROPORCIONAIS,
DIGITALIZANDO-OS PARA SEREM
ANALISADOS NO COMPUTADOR.
A medida proveniente de cada detector
denominada Parmetro
Parmetro 1 FSC
Parmetro 2 SSC
Parmetro 3 FL1
Parmetro 4 FL2
Parmetro 5 FL3
SISTEMA ELETRNICO
FLUORESCNCIA
O que a fluorescncia ?
Comprimento de onda gerado pela excitao dos
fluorocromos, aps atingir a absoro mxima da
luz do laser
Luz Fluorescente emitida
de menor energia e maior
comprimento de onda
Fluorescena
= 530 nm
Luz Incidente de
maior energa Fluorocromo
CO
2
H
O
O
H
= 480 nm
FLUORESCNCIAS
O detector de FL-1 (Fluorescncia 1) capta
luz de comprimento de onda 530 nm, que
corresponde luz verde.
O detector de FL-2 (Fluorescncia 2) capta
luz de comprimento de onda 570 nm, o que
corresponde luz laranja.
O detector de FL-3 (Fluorescncia 3) capta
luz de comprimento de onda 650 nm, o que
corresponde luz vermelha.
SISTEMA ELETRNICO
DISPERSO
POLIMORFONUCLEARES
LINFCITOS
MONCITOS
DEBRIS/HEMCIAS/PLAQUETAS
BLASTOS
V
O
L
U
M
E
(
F
S
)
DISPERSO:
S
i
d
e
S
c
a
t
t
e
r
Forward Light Scatter
0 200 400 600 800 1000
0
2
0
0
4
0
0
6
0
0
8
0
0
1
0
0
0
Linfcitos
Moncitos
Neutrfilos
Viso dos dados coletados
S
i
d
e
S
c
a
t
t
e
r
Forward Light Scatter
0 200 400 600 800 1000
0
2
0
0
4
0
0
6
0
0
8
0
0
1
0
0
0
CD3 FITC
C
D
4
P
E
0 200 400 600 800 1000
0
200
400
600
800
1000
DOT PLOT: FSC x SSC e FL1 x FL2
ALGUNS MARCADORES
CD3- presente no citoplasma e posteriormente na membrana de 95% dos
timcitos.
CD4- 55% a 65% das clulas T perifricas maduras, especialmente no subtipo
auxiliar, mas tambm em moncitos, macrfagos e clulas dendrticas
CD8- 25% a 35% das clulas T maduras do subtipo citotxica.
CD19- presente em mais de 95% das clulas B.
CD20- assim como o CD19 est presente em todas as clulas B maduras do
tecido linfide e sangue perifrico.
CD45- expresso quase exclusivamente em clulas hematopoiticas podendo
apresentar as formas : CD45RA ou CD45RO.
CD56- marcador de NK, no est expresso em clulas B, moncitos ou
granulcitos.
CD10
CD2
CD20
CD3
CD7
CD19
CD22
CD23
CD26
CD5
Leucemias Linfociticas ou
Enfermidade residual mnima
CD3
CD7
HLA DR
CD 42a
CD 61
CD19
CD33
CD13
CD14
CD34
Leucemias mielides
CD3
CD7
CD2
CD19
CD5
CD56
Linfomas e Mielomas
LEUCEMIAS
APLICAES CLNICAS
- Anlise da subpopulao linfoctica
- Diagnstico e acompanhamento de leucemias e linfomas
- Diagnstico e acompanhamento de mieloma mltiplo
- Deteco de clulas neoplsicas no-hematopoiticas
- Monitoramento quimioteraputico / doena residual mnima
- Anlise de reticulcitos
- Diagnstico de hemoglobinria paroxstica noturna
- Deteco de anticorpos antiplaquetrios
- Anlise do contedo de DNA
- Quantificao de clulas progenitoras (Stem cells)
- Avaliao imunolgica de paciente transplantado, de infuso
linfocitria
OBRIGADO A TODOS!