Micro diseccin Lser

Alumno: Pablo Vilches V

Introduccin
La micro diseccin por captura lser es una
tecnologa que permite separar clulas
nicas o pequeos grupos celulares de
manera selectiva, eficiente y rpida, a partir
de cortes, extendidos o cultivos.

Permitiendo la investigacion sistemtica de
calidad y cantidad.

ADN
ARN
Protenas
Lser

Bsicamente dispositivo capaz de emitir un haz de luz muy
potente.
El corte por lser es un procedimiento de divisin trmico.
Donde el rayo se genera (en la fuente o resonador) y se gua
mediante un espejo al cabezal de corte, donde se enfoca a un
dimetro muy reducido y de mucha potencia con una lente.
El rayo lser enfocado entra en contacto con la muestra y hace que
sta se funda.
En trminos simples como funcionan el lser


Capture IR Laser preserva la calidad del ARN para reas pequeas y
disecciones de clulas individuales

El lser ultravioleta (UV) puede ser utilizado para cortar el tejido y facilitar la
captura o para eliminar tejido no deseado.

Tcnica (LCM)

El sistema de micro diseccin por captura lser (LCM) ArcturusXT est montado
sobre un microscopio ptico invertido (Nikon Eclipse Ti-E) que permite
observar el tejido y seleccionar las regiones de inters a travs de una
computadora.

Una membrana termo fusible de 6mm de dimetro pegada a una pequea pieza
plstica llamada CapSure es el elemento que captura la muestra.


El CapSure se coloca apoyado sobre el corte de tejido en la regin de inters, luego
un lser infrarrojo (IR) de baja energa funde la membrana especficamente sobre las
clulas seleccionadas adhirindolas a la membrana.


El lser ultravioleta (UV) puede ser utilizado para cortar el tejido y facilitar la
captura o para eliminar tejido no deseado.

El CapSure se levanta llevando consigo el tejido adherido a la membrana.

Una vez terminada la microdiseccin se observa la eficiencia y se documenta
fotografiando el resultado.
El proceso se realiza en
forma automatizada,
controlado por computadora
con la mnima intervencin
manual necesaria para
abastecer al instrumento y
retirar las muestras.

Finalmente cada CapSure
con el tejido capturado se
encastra con un tubo de 0,5
ml conteniendo la solucin
de extraccin para las
molculas de inters.
Con que cuenta el LCM

El sistema se encuentra montado sobre un microscopio invertido Nikon
Eclipse Ti-E de objetivos y platina motorizada.

Cuenta con ptica de campo claro y contraste de fase y dos cmaras
CCD color, una para operar el sistema en vivo y otra para fotografas
de alta resolucin.

El equipo cuenta con 4 objetivos de aire y un lente 1,5x que aumenta la
magnificacin de cualquier objetivo en un 50%.
Consejos generales:
Extraccinrapida
Fijacin Oportuna ( evitar la auto
degradacin de biomolculas)
Evitar contaminacin de cualquier
tipo ( recambio de guantes, uso de
materiales nuevos en lo posible)
Limpieza de los equipos
Uso de materiales y reactivos libres
de nucleasas.

En general un manejo prolijo y limpio ya que las muestras pueden ser
contaminadas muy fcilmente.

Preparacin de la muestra
Reconocimiento de las clulas de inters
De esto depende la selectividad de la micro diseccin
2 casos posibles
Observar al microscopio y reconocer estructuras en cortes que NO
embebidos en medio de montaje.

Tincin una marcacin especfica. La micro diseccin lser
es compatible con mtodos para marcar clulas selectivamente.
(inmunohistoqumica o hibridacin in situ.)
TINCIONES
La tincin nuclear realizada con reactivos debe ser libres de nucleasas y
proteasas para que no interfieran con reacciones de RT- PCR que
puedan generarse a posterior con ARN aislado.

Tejido congelado (Kit Histogene).
Hematoxilina (Mayer) y Eosina (congelado, FFPE)
Cresilo Violet (secciones congeladas)
Azul de toluidina (seccin congelada)

Tejido fijado y parafinado (Paradise Staining Kit).
Hematoxilina (Mayer) y Eosina (congelado, FFPE)

Obs.
La tincin previo a la micro diseccin.
Tiempo total tincin debe ser tan corto como sea posible.
Compatible con fluorescencia (FISH / HIQ).
Utilidades en:
Microdiseccin lser y los mtodos de biologa molecular
La investigacin del ADN
Investigacin ARN
Protemica
Los cultivos de clulas
Investigacin de Plantas
Medicina forense
Neurologa
Investigacin del cncer
Microdiseccin lser y los mtodos de
biologa molecular

El general el xito de estas tcnicas depende de precisin y la
NO presencia de agentes contamintes. El aislamiento sin contacto y la
separacin ofrecida por el mtodo de microdiseccin por lser es
especialmente adecuado para las siguientes estructuras:

Las clulas individuales de muestras de tejidos
Componentes de la clula
Las reas de tejido
Cromosomas
Cultivos celulares

Mtodos biolgicos moleculares y bioqumicos:
- PCR
- PCR en tiempo real
- transferencias Southern, etc

Investigacin ARN
-Anlisis de la expresin gnica (informacin cuantitativa y cualitativa sobre
la actividad gentica). Tecnologa de microarrays.
-Examinar la expresin de muchos genes al mismo tiempo.
Protemica
La protemica (dilucidacin de la estructura, el anlisis cuantitativo de la
expresin de protenas y sus interacciones)
- informacin sobre los componentes de las vas metablicas y circuitos
reguladores.

Microdiseccin lser es de nuevo til en este caso para la seleccin y
aislamiento de clulas en preparacin para anlisis protemico.
Conclusin
Esta tecnologa que originalmente fue desarrollada para el anlisis
molecular de tumores, hoy puede ser aplicada en una gran variedad
de tejidos, y abre nuevas posibilidades en el estudio de las bases
moleculares de numerosas enfermedades.

Siendo una gran herramienta para la investigacin y desarrollo en
biomedicina.
Bibliografa
http://www.leica-microsystems.com/science-lab/topics/laser-
microdissection/
http://www.nikoninstruments.com/es_AMS/Centro-de-
Informacion/Microdiseccion-Laser
http://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-
microdissection/applications-of-laser-microdissection/
LCM Protocols and Techniques/2009 LCM User Meeting/Shirley
Chu/Applications Scientist/Arcturus LCM Products