Análisis de comunidades microbianas mediante técnicas de cultivo y actividad microbiana

Anlisis de comunidades microbianas basadas en
tcnicas de cultivo.
Anlisis molecular de las comunidades microbianas.
Medicin de la actividad microbiana en la
naturaleza.
1 Dra. Flor Teresa Garca Huamn
La ecologa microbiana trata de la interaccin de los
microorganismos entre s y su ambiente.
Los eclogos microbianos se dedican principalmente a dos
reas de estudio.
La bidiversidad
Qu incluye el aislamiento, identificacin y cuantificacin
de microorganismos en hbitats diversos.
La actividad microbiana
Es decir, lo que los microorganismos hacen en sus
hbitats.

La ecologa microbiana tiene dos grandes objetivos:
Apreciar la biodiversidad de los microorganismos
y entender la interaccin entre los diferentes
grupos que componen la comunidad.
Medir la actividad de los microorganismos en la
naturaleza y controlar sus efectos en el
ecosistema.
Dra. Flor Teresa Garca Huamn 3
Este proceso consiste en separar los organismos de
inters de una comunidad microbiana, un
procedimiento que se conoce como
ENRIQUECIMIENTO, y que permite aislarlos despus en
un cultivo axnico. El aislamiento es importante por
que se obtienen cultivos para estudios detallados y
controlados de laboratorio y para su aplicacin en
biotecnologa y microbiologa ambiental e industrial.

En un ambiente natural no es frecuente encontrar un solo tipo
de microorganismo. Lo que existe son comunidades microbianas,
y el desarrollo de mtodos y procedimientos que permitan el
aislamiento y cultivo de microorganismos inters es un reto para
el eclogo microbiano.

El enfoque ms corriente para alcanzar este propsito es la
TECNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO.
TCNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO
Este mtodo requiere que el medio de cultivo y las condiciones
de incubacin sean selectivos para el organismo que se desea
aislar y contra selectivos para los organismos no deseados.

Por tanto se necesita reproducir lo ms fielmente posible los
recursos y las condiciones que se dan en este nicho ecolgico y
buscar luego los habitantes potenciales de aquel hbitat
capaces de desarrollarse en las condiciones de enriquecimiento
seleccionadas.
Para que un cultivo de enriquecimiento tenga xito es
necesario contar con un inculo apropiado (una
muestra que contenga el microorganismo). Por tanto, la
metodologa del cultivo de enriquecimiento se inicia
con la eleccin del hbitat adecuado.

El cultivo de enriquecimiento suele establecerse
sembrando el inculo directamente en un medio
altamente selectivo; muchos de los procariotas ms
frecuentes pueden aislarse de esta manera.
Por ejemplo, el microbilogo holndes Martinus Beijerink, a
quien se deben las primeras tcnicas de cultivo de
enriquecimiento, aisl por primera vez la bacteria fijadora de
nitrgeno Azotobacter por medio de lo que despus se
convirti en una estrategia clsica de enriquecimiento.

Como Azotobacter puede crecer rpidamente fijando N
2
del aire,
los medios de enriquecimiento carentes de amoniaco u otras
formas de nitrgeno fijado son muy selectivos para este
organismo; las bacterias no fijadoras de nitrgeno o las bacterias
fijadoras de nitrgeno anaerbicas son contra seleccionadas con
este mtodo.

Tanto el medio de cultivo como las condiciones de
incubacin son crticos para que tenga xito un cultivo
de enriquecimiento; es decir deben optimizarse tanto
los recursos como las condiciones para tener las
mejores posibilidades de enriquecer el microorganismo
que interesa.

Tradicionalmente, la columna de Winogradsky se ha utilizado en
el cultivo de enriquecimiento para el aislamiento de bacterias
fototrficas rojas y verdes, de bacterias sulfatoreductoras y de
muchos otros anaerobios.

El nombre corresponde al famoso microbilogo ruso Sergei
Winogradsky, quien utiliz la columna por primera vez a finales
del siglo XIX para estudiar microorganismos del suelo.

La columna de Winogradsky es un ecosistema anxico en
miniatura, que puede usarse como suministro a largo plazo de
bacterias para cultivos de enriquecimiento.
La columna de Winogradsky se prepara con un cilindro de vidrio
grande que se llena aproximadamente hasta la mitad con lodo
rico en materia orgnica, y que preferiblemente contenga
sulfuro.

Los sustratos de carbono se mezclan previamente con el lodo;
stos determinarn que organismos sern enriquecidos, pero
deben evitarse los sustratos fcilmente fermentables (que
pueden llevar a una formacin excesiva de gas). Al lodo se le
aade CaCO
3
y CaSO
4
como tampn y como fuente de sulfato
respectivamente.
El lodo se compacta en el envase, cuidando de no atrapar aire.
El lodo se cubre con agua de un lago, embalse o acequia (o
agua de mar si se prepara una columna marina), y se tapa el
cilindro para evitar la evaporacin. Se coloca el cilindro cerca
de una ventana donde reciba luz solar atenuada y se deja
durante varias semanas.
En una columna de Winogradsky tpica se desarrolla una mezcla de
organismos.

Las algas y cianobacterias ocupan rpidamente la parte superior y al
producir O
2
ayudan a mantener esta zona xica.

El proceso de descomposicin en el sedimento lleva rpidamente a
la produccin de cidos orgnicos, alcoholes y H
2
, sustratos
adecuados para las bacterias sulfato reductoras.

El sulfuro producido por las bacterias sulfato reductoras
provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del
azufre.

Estos organismos aparecen generalmente como zonas
de crecimiento en el lodo de la columna, pero tambin
pueden desarrollarse profusamente en el agua si los
fottrofos oxignicos son escasos.

Para el muestreo de bacterias fototrficas de la columna se
introduce una pipeta larga con la que se recoge un poco de lodo
o agua coloreada. Estas muestras se pueden usar para
microscopa y para inocular medios de enriquecimiento para
aislamiento y caracterizacin.
SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO
Aunque el cultivo de enriquecimiento es una herramienta
poderosa, en muchos casos se produce un sesgo en el
enriquecimiento.

En los cultivos lquidos de enriquecimiento tpicos, el organismo
ms adaptado a las condiciones escogidas puede convertirse en
la poblacin dominante.

Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado en los cultivos
de laboratorio a menudo es slo un componente minoritario del
ecosistema microbiano, en lugar de ser el mayoritario o el ms
relevante desde el punto de vista ecolgico.
El sesgo en el enriquecimiento puede demostrarse cuando
se comparan los mtodos de dilucin con el clsico
enriquecimiento en lquido.

La dilucin del inculo seguida de un enriquecimiento a
menudo da lugar a un organismo diferente que cuando se
enriquece un inculo sin diluir.

Se cree que la dilucin elimina aquellas poblaciones
minoritarias pero de rpido crecimiento, dando de este
modo la oportunidad de desarrollarse a otros miembros de
la comunidad. Por tanto, la dilucin del inculo es una
prctica comn en el cultivo de enriquecimiento en la
microbiologa actual.

Los cultivos axnicos (o puros) se pueden obtener de
muchas maneras a partir de un enriquecimiento; los
mtodos empleados ms frecuentes son la siembra
por estra en superficie (en placa petri), la siembra en
profundidad (agar shake) y la dilucin en lquido. Para
aquellos microorganismos que crecen bien en medio de
cultivo slido (con agar), el mtodo de eleccin es la
siembra por estra.
A partir de una poblacin mixta, mediante la siembra
por estra se obtienen colonias separadas; repitiendo
esta tcnica con una de estas colonias aisladas se
consigue un cultivo axnico, que puede ser transferido
a un medio lquido.

Las placas sembradas de este modo e incubadas en las
condiciones adecuadas (por ejemplo en una jarra
anxica para anaerobios) nos permiten aislar tanto
microorganismos aerobios como anaerobios.
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD Y NMERO MS PROBABLE
El mtodo de siembra en profundidad consiste en la dilucin de
un cultivo mixto en tubos de agar fundido; cuando el agar
solidifica, las colonias se desarrollan embebidas en el tubo de
agar en vez de en la superficie, como ocurre en la siembra por
estra en placa.

Es un mtodo de gran utilidad para purificar determinados tipos
de microorganismos anaerobios, por ejemplo, las bacterias
fototrficas del azufre y sulfato reductoras de las columnas de
Winogradsky.
Es posible obtener cultivos axnicos mediante
diluciones sucesivas de una suspensin de clulas en
tubos de agar fundido. A partir de una colonia crecida
en el tubo de mayor dilucin utilizada como inculo, se
puede volver a hacer otro banco de diluciones, de tal
manera que se acabe obteniendo un cultivo axnico.
Un procedimiento similar sin usar agar es la dilucin seriada de
un inculo en un medio lquido hasta que el tubo o tubos finales
de la serie no muestran crecimiento.

Utilizando diluciones seriadas de diez en diez, por ejemplo, el
ltimo tubo que muestre crecimiento tiene que haberse
originado a partir de 10 clulas o menos. Si se repite varias veces
este proceso se obtienen cultivos axnicos. Esta tcnica se
conoce como la Tcnica del Nmero Ms Probable (NMP).
La Tcnica del NMP se usa para estimar el nmero de
microorganismos en alimentos, aguas residuales y en otras
muestras donde hay que evaluar rutinariamente el nmero de
clulas. Se puede hacer con medios altamente selectivos y
condiciones de incubacin dirigidos a uno o a un pequeo grupo
de organismos, como por ejemplo un determinado patgeno, o
usando un medio complejo para obtener una estimacin del
nmero total de clulas.

Con independencia del mtodo utilizado para purificar
el cultivo, una vez obtenido un supuesto cultivo axnico
es esencial comprobar su pureza. Se utiliza para ello
una combinacin de tcnicas microscpicas,
observacin de las caractersticas de la colonia en
placas, o en siembras en profundidad en tubo, y
comprobacin del crecimiento en medios donde el
microorganismo que nos interesa aislar crece muy
poco, pero que favorecen el crecimiento de los
microorganismos acompaantes.
La observacin microscpica de un solo tipo
morfolgico de clula, junto con unas caractersticas
uniformes de la colonia y ausencia de contaminacin
en test con diversos medios de cultivo, puede tomarse
como prueba de que un cultivo es axnico (puro).
CULTIVOS AXNICOS DE ALTA TECNOLOGA: LAS PINZAS DE LSER
Adems de los mtodos clsicos descritos, los avances
tecnolgicos han permitido la utilizacin de nuevas herramientas
para la obtencin de cultivos axnicos; una de ellas son las pinzas
(pticas) de lser.

Las pinzas de lser consisten en un microscopio ptico invertido
equipado con un laser infrarrojo enfocado con precisin y un
instrumento de micro manipulacin.
Una clula individual del campo de visin es atrapada por el haz
de rayos laser y separada del resto de microorganismos. La clula
queda atrapada por que la fuerza creada por el lser que empuja
hacia abajo los objetos pequeos (como las clulas microbianas)
y los mantiene en el lugar; cuando el haz de lser se desplaza, las
clulas atrapadas se mueven junto con l. Si la muestra est en
un tubo capilar, se atrapa una nica clula que despus se asla
rompiendo el tubo en un punto entre la clula y el resto de la
poblacin.

La clula recogida se introduce entonces en un tubo pequeo de
medio estril para iniciar su crecimiento como cultivo axnico.
La tecnologa de pinzas de lser es especialmente til para el
aislamiento de bacterias de desarrollo lento, que pueden ser
superadas por el desarrollo rpido de otras poblaciones en los
cultivos de enriquecimiento tpicos, o para los organismos
presentes en nmeros tan bajos que podran perderse con los
mtodos de enriquecimiento a partir de la dilucin. Y junto con
el uso de tinciones especficas capaces de identificar organismos
determinados en un campo del microscopio, las pinzas de lser
se emplean para seleccionar organismos a partir de una mezcla
para su purificacin y posterior estudio en el laboratorio.

A.- VIABILIDAD Y CUANTIFICACIN MEDIANTE TCNICAS
DE TINCIN
B.- TINCIONES GENTICAS
C.- PCR: RELACIONANDO GENES ESPECFICOS CON
ORGANISMOS ESPECFICOS.
A.- VIABILIDAD Y CUANTIFICACIN MEDIANTE TCNICAS DE TINCIN

1. Tincin Fluorescente con DAPI.
2. Tincin de viables.
3. Anticuerpos fluorescentes.
4. Protena fluorescente verde para el etiquetado celular.

1.-Tincin Fluorescente con DAPI:

Las tinciones fluorescentes se han usado mucho para teir
microorganismos en hbitats opacos. El colorante DAPI (4,6-
diamido-2-fenilindo) se utiliza con frecuencia para este
propsito; las clulas teidas con DAPI presentan fluorescencia
azul brillante y son muy fciles de ver y enumerar. La tincin
DAPI se emplea para la enumeracin de microorganismos en
muestras clnicas, del ambiente y de alimentos.

Dependiendo de la muestra, la tincin con colorantes
fluorescentes no especficos puede representar un problema,
pero el DAPI, que tie cidos nucleicos, no suele reaccionar con
la materia inerte.
Por tanto, para muchas muestras de suelo y agua, la tincin DAPI
proporciona una estimacin razonable del nmero de clulas
presente. Para muestras acuticas, las clulas se tien en la
superficie de un filtro despus de haber filtrado un volumen
determinado de lquido. Estas tcnicas sencillas tienen la ventaja
de no ser especficas (tien todos los microorganismos de una
muestra), pero con el inconveniente de que no diferencian entre
clulas vivas y muertas, ni permiten el rastreo de organismos
especficos en el ambiente.
2.-Tincin de viables :
Se ha desarrollado una tincin con colorantes fluorescentes que
diferencia entre clulas vivas y muertas. Esto proporciona
informacin no slo del nmero de organismos de una muestra
sino tambin de su viabilidad. Esta distincin se basa en la
integridad de la membrana citoplasmtica celular.

A la muestra se aaden dos colorantes, verde y rojo; el colorante
fluorescente verde penetra en todas las clulas, viables o no,
mientras que el rojo, que contiene yoduro de propidio, penetra
slo en aquellas clulas cuya membrana ya no se encuentra
intacta y por tanto, estn muertas.
Las clulas verdes estaban vivas y las rojas muertas, lo
que ofrece una evaluacin instantnea de la viabilidad.
Este mtodo se utiliza con cultivos bacterianos de
laboratorio, pero no es adecuado para el examen
microscpico de hbitats naturales debido a
problemas de tincin inespecfica de los materiales
inertes.
3.-Anticuerpos Fluorescentes:
Las tcnicas de tincin con sustancias fluorescentes pueden
hacerse ms especficas con el empleo de anticuerpos
fluorescentes.

La gran especificidad de los anticuerpos frente a los
constituyentes de la superficie de un organismo particular puede
explotarse para identificar o rastrear un organismo en un hbitat
complejo; por ejemplo, suelo o una muestra clnica que contenga
una mezcla de muchos organismos.
El mtodo requiere la preparacin de anticuerpos especficos
contra los organismos que interesan, lo cual es largo y laborioso.

Sin embargo, para el caso de microorganismos de importancia
clnica, se dispone comercialmente de anticuerpos de alta
especificidad.
4.-Protena Fluorescente Verde para el Etiquetado Celular:
En el genoma bacteriano se puede insertar un gen que codifica
una protena fluorescente verde (GFP, green fluorecens protein).
Al expresarse, las clulas que contienen la GFP aparecen de color
verde cuando se observan con un microscopio de luz
ultravioleta.

Aunque no resulta til para el estudio de poblaciones naturales
(por que estas clulas carecen del gen GFP), las clulas
etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio, como las
races de las plantas y seguir con el microscopio la cepa
etiquetada.
Con este mtodo los eclogos microbianos pueden estudiar in
situ la competencia microbiana entre la microbiota nativa y la
cepa con GFP introducida o evaluar el efecto de la perturbacin
en el ambiente.

La GFP tambin se ha usado ampliamente en cultivos de
laboratorio como gen indicador.
B.- TINCIONES GENTICAS
1.- TINCIN FILOGENTICA CON HIBRIDACIN FLUORESCENTE
IN SUTU (FISH, fluorescen in situ hybridization).
2.- TINCIN DE CROMOSOMAS Y TRANSCRIPCIN INVERSA IN
SITU.
1.-TINCIN FILOGENTICA CON HIBRIDACIN FLUORESCENTE IN SUTU :
Los colorantes filogenticos son oligonucleotidos fluorescentes
complementarios en la secuencia de base a las secuencias en el
ARNr 16s o 18s. Los colorantes filogenticos penetran en la
clula, donde hibridan con el ARNr directamente en los
ribosomas.

Como se han identificado sondas filogenticas para especies
microbianas individuales, as como para dominios enteros de
organismos, el grado de especificidad de un colorante
filogentico puede controlarse mediante la secuencia de la
sonda fusionada. La FISH permite identificar o rastrear un
organismo particular o un grupo de organismos relacionados,
dependiendo de la especificidad de la sonda.
2.-TINCIN DE CROMOSOMAS Y TRANSCRIPCIN INVERSA IN SUTU:
La tincin de cromosomas se emplea para identificar genes
especficos de la microbiota de muestras naturales, mientras que
la transcripcin se dirige a un ARNm especfico (es decir genes
expresados).

La tincin de cromosomas se inicia con el marcado fluorescente
de una sonda de oligonucletidos o del gen completo, de un
conjunto de genes, o incluso de un genoma completo digerido
para obtener sondas pequeas. Las sondas se utilizan para
averiguar que organismo(s) de una muestra contiene(n) el gen o
los genes presentes en las sonda(s).
La tincin de cromosomas es til para identificar bacterias que
contienen genes especficos, como los que codifican la
nitrogenasa (responsable de la fijacin del nitrgeno), los
componentes del centro de reaccin fotosinttico, o vas
autotrficas especficas.

Los nmeros de clulas fluorescentes en cada caso daran una
estimacin de las bacterias fijadoras de nitrgeno, fottrofas o
auttrofas, respectivamente, en una muestra natural.

A diferencia de la tcnica anterior, la transcripcin inversa in situ,
busca si un organismo est expresando un gen o genes
determinados en la naturaleza en un momento determinado.

El mtodo utiliza una sonda que hibrida con un ARNm especfico
previamente transcrito por las clulas en una muestra.

Una vez que la sonda reacciona, tiene lugar la transcripcin
inversa, produciendo un ADN complementario que es
amplificado por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).

Finalmente, el ADN amplificado reacciona con una sonda
fluorescente.
C.- PCR: RELACIONANDO GENES ESPECFICOS CON ORGANISMOS ESPECFICOS.
Muchos estudios en ecologa microbiana no necesitan
aislar los microorganismos, ni siquiera identificarlos por
microscopa con las tinciones antes descritas.

Generalmente, el objetivo de un estudio es evaluar la
biodiversidad de un hbitat sin emplear tcnicas de
cultivo, ni observar clulas. Con este objetivo, se han
aislado y caracterizado genes especficos como medida de
la biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los
genes especficos estn ligados frecuentemente a
organismos especficos la deteccin del gen implica la
presencia del organismo.
Las principales tcnicas en este tipo de anlisis
microbiano son:
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y anlisis de la comunidad
microbiana.
Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE): Separacin
de genes similares.
Clonacin molecular
Secuenciacin y anlisis de ADN

Cualquier medicin de la actividad microbiana (reduccin de
sulfato, fotosntesis, respiracin etc.) en una muestra natural es
una estimacin colectiva del conjunto de la comunidad
microbiana.

Radioistopos Microelectrodos Istopos estables

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