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BIOENGENHARIA

Captulo -12 Purificao de Produtos Biotecnolgicos



12.1 Introduo
12.2 Definio e Escolha do Processo de Purificao
12.3 Clarificao
12.4 Rompimento de Clulas Microbianas
12.5 Purificao de Baixa Resoluo
12.6 Purificao de Alta Resoluo
12.7 Tratamentos Finais
12.8 Exerccios Resolvidos
12.1 Introduo
A diversidade e crescente importncia apresentada pelos produtos biotecnol-
gicos incentivou o desenvolvimento de vrios processos de purificao, (ope-
raes unitrias), bem como estmulou a introduo de modificaes genticas
no desenvolvimento do microorganismo, com o objetivo de aumentar a resolu-
o na purificao, integrando as etapas de desenvolvimento do processo.
Produtos da indstria biotecnolgica so altamente diversificados :
- cidos orgnicos
- Antibiticos
- Polissacardeos
- Hormnios
- Aminocidos
- Peptdeos
- Protenas
Suas localizaes na clula tambm variam conforme o produto.

Portanto, no h processos de purificao de aplicao geral.
O processo de purificao pode ser dividido em 4 etapas principais :
Etapas do Processo Objetivo da Etapa Operaes Unitrias
Clarificao
Separao de clulas e seus
fragmentos do meio de cultivo.
- Filtrao convencional
- Centrifugao
- Filtrao tangencial
- Floculao
Rompimento de Clulas
Promover a retirada do produto
das clulas para o meio de
cultivo.
- Homogeinizao
- Moagem em moinho de bolas
- Rompimento qumico
- Rompimento enzimtico
Purificao de Baixa Resoluo
Separao da molcula alvo, por
exemplo uma protena, em
relao a molculas com
caractersticas fsico-qumicas
significativamente diferentes,
tais como gua, ions, pigmentos,
cidos nucleicos,
polissacardeos e lipdeos).
- Precipitao
- Ultrafiltrao
- Extrao em sistemas de
duas fases lquidas.
Purificao de Alta Resoluo
Compreende a separao de
classes de molculas com
algumas caractersticas fsico-
qumicas semelhantes, como por
exemplo protenas.
- Cromatografia de troca inica
- Cromatografia de afinidade
biolgica ou qumica.
- Cromatografia de fase
reversa
- Cromatografia de excluso
molecular.
Tratamentos Finais
Operaes de acondicionamento
final do produto.
- Cristalizao
- Liofilizao
- Secagem
E
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Baixa resoluo
Alta resoluo
A definio das operaes unitrias de um processo de purificao depende
do uso da molcula alvo, suas caractersticas fsico-qumicas, bem como aquelas
das impurezas.

Produtos destinados a usos teraputicos so, obviamente, os que requerem
maior nvel de pureza e, portanto, a complexidade do processo de purificao
maior.

Uma medida dessa complexidade o custo do processo de purificao em
relao ao custo final do produto, o qual pode chegar a 80%.

Em resumo, pode dizer que o sucesso tcnico e econmico do processo est re-
lacionado seleo adequada das tcnicas e da ordem de aplicao das mesmas.
de forma geral, algumas regras podem ser analisadas para uma abordagem inicial:
- Escolha de processos de purificao baseados nas diferenas apresentadas em
uma dada propriedade fsico-qumica das molculas (produto e impurezas);
- Remoo das impurezas presentes em maior concentrao nas etapas iniciais
do processo;
- Aplicao de tcnicas de alta resoluo em relao ao produto, nas etapas
finais do processo.
12.2 Definio e Escolha do Processo de Purificao
OPERAO UNITRIA CARACTERSTICAS DETERMINANTES
Centrifugao
Densidade e tamanho das clulas,
Viscosidade do meio.
Filtrao convencional
Compressibilidade e tamanho das
clulas.
Microfiltrao Tamanho das clulas ou partculas.
Homogeinizao
Resistncia fsica da parede celular ao
gradiente de presso.
Moinho de bolas
Resistncia fsica da parede celular
tenso de cisalhamento.
Extrao em SDFA precipitao Solubilidade de protenas.
Cromatografia de troca inica Mobilidade eletrofortica de protenas.
Ultrafiltrao, gel filtrao Massa molecular
A determinao da caractersticas do produto e das principais impurezas
fundamental no sucesso das operaes subsequentes de purificao
propriamente dita, uma vez que o fracionamento est baseado nas proprie-
dades fsico-qumicas das molculas envolvidas :
Alguns critrios norteiam a escolha das op. unitrias de clarificao e homogeinizao :
- Grandes volumes de suspenses de leveduras so eficientemente clarificados por
centrifugao, enquanto que para volumes moderados de suspenses , uma
comparao entre a centrifugao e a filtrao tangencial pode ser feita.
- Micoorganismos filamentosos, por outro lado, so clarificados atravs de filtrao
convencional, devido reduzida velocidade de sedimentao destes organismos
de baixa densidade.
A modificao da estrutura de molculas um recurso importante para o aumento do poder
de resoluo de determinadas operaes de purificao e, consequentemente , reduo do
nmero de etapas envolvidas.
- Por exemplo, a introduo de sequncias terminais estrutura da protena alvo que a
enderecem para o espao periplsmico e implementao destas modificaes via em-
genharia gentica, possibilita a extrao apenas das molculas do espao periplasm-
tico, o que significa menor contaminao da molcula alvo.
- Por exemplo, um peptdeo humano de ao diurtica e hipotensiva, de apenas 2 kda,
foi modificado pela introduo da sequncia relativa a uma protena natural de E. coli ,
a tioredoxina de 11.700 kda, e uma sequncia de 6 histidinas em seu gene estrutural,
constituindo uma molcula de fuso. A primeira modificao teve por objetivo aumentar
o nvel de produo intracelular do peptdeo e protege-lo da ao de proteases; a segun-
da modificao destina-se a tornar a molcula passvel de purificao em processo cro-
matogrfico por afinidade com ions nquel imobilizados na matriz. A molcula foi total-
mente purificada unicamente por este processo, aplicado fase solvel das clulas rom-
pidas. Aps a purificao, foi necessria uma hidrlise efetuada por enzima especfica
sobre o stio introduzido para este fim (stio de clivagem), a fim de se obter o peptdeo
somente.
A adsoro em leito expandido tem sido cada vez mais adotada, pois possibilita a
reduo do nmero de etapas, uma vez que a captura de protenas se d a partir
de meios que contm partculas, procedimento que viabiliza a clarificao de uma
suspenso ou de um homogeinizado de clulas e a purificao da molcula alvo
em uma nica operao. Alm disso, a reduo do tempo de processamento dimi-
nui a possibilidade de hidrlise da molcula alvo por ao de proteases, normal-
mente presentes quando se trata de produtos intracelulares.
importante comentar que alm das caracterizaes fsico-qumicas das
molculas, tambm devem ser consideradas caractersticas inerentes s
operaes. Por exemplo, na gel filtrao ocorre diluio significativa, isto
, a concentrao das molculas nas fraes coletadas menor que a
concentrao no meio injetado na coluna. Por essa razo, a gel filtrao
empregada na ltima etapa de um processo de purificao, pois do contr-
rio, acarretaria umento do volume do meio a ser tratado ao longo do pro-
cesso. Ao final do processo, pode-se empregar a utrafiltrao para ajuste
da concentrao. A cromatografia de troca inica, ao contrrio da gel filtra-
o, promove o aumento da concentrao das molculas.
12.3 Clarificao
A separao de clulas suspensas de um meio de cultivo frequentemente a
primeira operao unitria de purificao. O meio resultante, isento de clulas,
denominado clarificado ou filtrado.

As operaes unitrias, nesta primeira etapa aps o processo de fermentao,
podem ser :

- Decantao
- Filtrao Convencional
- Filtrao Tangencial
- Centrifugao

A figura abaixo ilustra a faixa de dimenso de partcula e a operao unitria :
Classificao de operaes unitrias de clarificao em funo das dimenses de clulas microbianas
12.3.1 - Decantao
Processo de separao slido-lquido que tem como fora
propulsora a ao da gravidade sobre as partculas slidas.
A velocidade de ascenso do
lquido (e de decantao das
partculas slidas) a
principal varivel e afetada
por :
L e S ; (T) ; dp e p
Concentrao de slidos em
suspenso (Lei de Stokes,
Velocidade Terminal)
Entrada
Suspenso
Slidos
Sada
Clarificado
Sada
Lama
Rastelo
Medidor
Densidade
Bomba
Velocidade
Varivel
Mecanismo
De Elevao
Torque
QA , CA
QL , CL
QB, CB
QC
zona
limite
VL
Dimensionamento Bsico de Decantadores ( rea )

- Mtodo pela Velocidade de Ascenso

Considera a velocidade de ascenso e concentrao em todas as interfaces das zonas de clarificao,
garantindo que a mnima velocidade de ascenso do lquido no provoque o arrastamento de partculas
slidas (mx. rea).
Fluxo de Lquido na Zona Limite (interface) QC = QA QB

VL = QA - QB S = QA - QB
S VL

Fluxo Mssico de Slidos em Regime Contnuo

QA . CA = QB . CB QB = QA . CA
CB
VL Conhecido e tabelado pelo histrico de
operao em instalaes existentes.
S = QA . ( 1 - CA )
VL CB
12.3.2 - Filtrao
Filtro Rotativo
a Vcuo
12.3.3 - Centrifugao
Na filtrao, o objetivo a obteno do meio clarificado, enquanto que na
centrifugao, alm deste adiciona-se o objetivo de obter uma massa de
clulas de forma que proporcione a recuperao e o reciclo destas clu-
las recuperadas para os fermentadores.
Quando as clulas ou o caldo fermentado
devem voltar ao biorreator, pode-se usar
centrfugas esterilizveis por vapor.
Fc deve ser mencionado
na caracterizao de
uma centrifugao
juntamente com o tempo
adotado para se obter
determinado grau de
clarificao.
12.4 Rompimento de Clulas Microbianas
Biomolcula Alvo
12.4.1 - Rompimento Mecnico
Muito utilizados industrialmente.

Dois equipamentos predominantes :
- Homogeinizador
- Moinho de bolas

O tamanho e aaforma das clulas, assim a estrutura da parede celular, so
fatores determinantes para o tipo de processo a ser utilizado.

- Os homogeinizadores so, basicamente, constitudos de pistes projetados
para aplicar altas presses suspenso celular, forando sua passagem
atravs de um orifcio estreito seguida de coliso contra uma superfcie em
uma cmara de baixa presso.
12.4.2 - Rompimento No-Mecnico
1) Choque Osmtico

No ocorre rompimento total das clulas;

Pode propiciar a permeabilizao seletiva;

As clulas so mantidas por 30 minutos em meio com
concentrao de sacarose de ~20% (m/v), separadas por
centrifugao e ressuspensas em gua destilada a 4C.

Mais indicado para bactrias Gram-negativas, pois possuem
parede celular mais sensvel que as Gram-positivas.
Rompimento total e permeabilizao seletiva
2. Congelamento-Descongelamento
As clulas passam por repetidos ciclos de congelamento e
descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem
perfurar a clula e provocar seu total rompimento ou lesion-la
formando poros permeveis biomolcula-alvo.

Fatores que mais influenciam:
tipo e idade da clula;
Temperatura
Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;


Mtodo de difcil implantao em grande escala

Enzimas sensveis ao congelamento podem ser inativadas
3. Termlise (Aquecimento)
Consiste no aquecimento da suspenso celular em banho
termostatizado, com injeo direta de vapor, tambor rotativo ou em
spray-drier.

Sos os mais utilizados para rompimento em larga escala devido
sua simplicidade;

Principalmente utilizados para algas, fungos filamentosos, leveduras
e bactrias destinadas produo de protena microbiana;

Apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores
dimenses e, portanto, de mais fcil remoo por filtrao ou
centrifugao.
Rompimento total de clulas de uma suspenso de E. coli (bactria Gram-negativa), ocorre
com aquecimento a 90 C por 15 minutos com liberao de enzimas intracelulares
Uma suspenso de Bacilus megaterium nas mesmas condies proporciona o rompimento
de menos da metade das clulas (bactria Gram-positiva- camada mais espessa de
peptideoglicano)


12.4.3 - Rompimento Qumico
1. lcalis
Adequado quando a molcula-alvo estvel em pH maior que 11
Mtodo simples e de baixo custo;
Ocasiona gerao de poluentes;
2. Detergentes
So capazes de dissociar protenas e lipoprotenas das paredes
celulares, provocando a formao de poros e liberar a molcula-alvo;
A clula pode ser totalmente rompida;
Ex.: lauril sulfato de sdio, Triton, etc.
Formao de espuma e desnaturao e/ou precipitao de protenas
3. Solventes
Consiste na desidratao das clulas, sendo os solventes mais
utilizados o etanol, metanol, tolueno e acetona;
Adequado para biomolculas que no sejam desnaturadas na
presena do solvente empregado;

12.4.4 - Rompimento Enzimtico
Lise enzimtica:

Mecanismo de rompimento: membrana citoplasmtica
rompida pela presso osmtica interna, aps a parede celular,
ou parte dela, ser removida por ao das enzimas, permitindo
que o contedo intracelular seja liberado.

Adequado para recuperao de biomolculas sensveis ao
rompimento mecnico, temperatura, tenso de cisalhamento e
elevadas presses.

Fatores a ser considerados: presena de inibidores,
possibilidade de reciclo da enzima.
Sistema enzimtico deve ser adequado para cada tipo de
microrganismo:

Leveduras: glucanases, proteases e mananases, as quais
hidrolisam componentes especficos da parede, como glucanas,
protenas e mananas.

Bactrias Gram-negativas: enzimas que ajam sobre as ligaes
covalentes da estrutura do peptideoglicano
Parede Celular Bacteriana Peptideoglicano
Ex.: lisozima, catalisa a
hidrlise das ligaes
glicosdicas do
peptideoglicano, mais
eficiente no rompimentos de
bactrias Gram positivas.
Preservao da Biomolcula-alvo
Adio de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da
degradao de protenas);

Adio de agentes redutores (para evitar a oxidao dos stios ativos
das enzimas aps o rompimento);

Adio de nucleases ou proteases podem melhorar as caractersticas
do meio, desde que no destruam a molcula de interesse;

Alterao de pH pode melhorar a viscosidade do meio.


12.5 Purificao de Baixa Resoluo
Concentrao e/ou Purificao de Baixa Resoluo consiste na
separao da molcula alvo, por exemplo uma protena, em relao a
molculas com caractersticas fsico-qumicas significativamente
diferentes, tais como gua, ions, pigmentos, cidos nucleicos,
polissacardeos e lipdeos).

As principais operaes unitrias envolvidas neste processo so :

- Precipitao

- Ultrafiltrao (filtrao por membranas)

- Extrao em sistemas de duas fases lquidas.

12.5.1 Precipitao da Molcula Alvo
Uma perturbao , qumica ou fsica, em uma soluo protica causa
a formao de partculas insolveis de protena, recuperadas
posteriormente por uma operao de separao slido-lquido
Precipitao :
Sem elevada capacidade de separao de diferentes protenas

Mtodo de moderado poder de purificao

Precede processos de elevada resoluo : cromatografia
Mtodo agressivo

Protenas precipitadas tm sua estrutura tridimensional modificada
Funo bioqumica depende da estrutura desta estrutura (enzima)

Portanto, s vivel quando a adequada conformao da protena
recuperada aps a precipitao
Os meios que contm a protena a ser purificada apresentam, em geral misturas
de diferentes biomolculas e as precipitaes devem ser conduzidas em duas ou
mais etapas :

Primeira etapa remoo de protenas indesejveis menos solveis

Seguintes etapas precipitao de um ou mais biomolcula alvo

Ppt simples, em um nico estgio concentrao

Ppt fracionada largamente utilizada industrialmente para a purificao
Inconvenientes :

Pouca reprodutibilidade dos resultados obtidos em laboratrio
Reduo da eficincia observada com o aumento da escala

- O sobrenadante de uma precipitao fracionada o material inicia para o
prximo fracionamento e podem ocorrer mudanas conformacionais e perdas.
- Principal varivel a concentrao de precipitante. Porm, pH, temperatura,
fora inica e concentrao de protenas tambm podem ser usadas como
variveis.
Precipitao Fracionada
Em solues aquosas a precipitao pode ocorrer por :
Precipitante Princpio Vantagens Desvantagens
Sais neutros
(Salting-out)
Interaes hidrofbicas pela
reduo da camada de hidratao
da protena
- Uso universal - Corrosivo
- Baixo custo - Liberao de amnia em pH alcalino
Polmeros no-inicos Excluso da protena da fase aquosa
reduzindo a quantidade de gua
disponvel para a solvatao da
protena
- Uso de pequenas quantidades
de precipitante
- Aumento da viscosidade
Calor interaes hidrofbicas e
interferncia das molculas de gua
nas ligaes de hidrognio,
- Baixo custo - Risco de desnaturao
- Simples
Polieletr-litos Ligao com a molcula de protena
atuando como agente floculante
- Uso de pequenas quantidades
de precipitante
- Risco de desnaturao
Precipitao isoeltrica Neutralizao da carga global da
protena pela alterao do pH do
meio
- Uso de pequenas quantidades
de precipitante
- Risco de desnaturao
Sais metlicos Formao de complexos - Uso de pequenas quantidades
de precipitante
- Risco de desnaturao
Solventes orgnicos Reduo da constante dieltrica do
meio aumentando as interaes
eletrostticas intermoleculares
- Facilidade de reciclagem - Risco de desnaturao de protenas
- Facilidade na remoo do
precipitado
- Inflamvel e explosivo
Precipitantes e princpios :
Estrutura das Protenas
Constituio

Aminocidos (aa) com
elevada massa molar
(> 6000Da); dos quase
200 aa conhecidos,
apenas 20 constituem
as protenas.

Os 20 aa das protenas
se diferenciam pela
cadeia lateral R, que
determina o carter
cido ou bsico do aa
em soluo.

Estrutura das Protenas

Estrutura primria: refere-se seqncia dos aminocidos na
cadeia linear peptdica.

Estrutura secundria: refere-se ao grau de ordenao espacial
da cadeia polipeptdica. So estruturas helicoidais ou folhas
pregueadas.

Estrutura terciria: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas
dobraduras e enrolamentos da estrutura secundria. Envolve a
otimizao de vrias interaes (hidrofbicas, eletrostticas e de
van der Waals) e pontes de hidrognio entre vrios grupos na
estrutura da protena.



As estruturas secundria e terciria conferem
protena a sua estrutura tridimensional.
Estrutura das Protenas

Estrutura quaternria: envolve a associao de
subunidades tercirias de protenas. Para sua
estabilizao concorrem ligaes inicas, pontes de
hidrognio, foras de van der Waals, pontes bissulfeto
e interaes hidrofbicas.
Solubilidade de Protenas










Regio
Hidrofbica
(Apolar)
Regies Hidroflicas
(Polares)
Determina sua solubilidade
Alm dos aa, ons ferro e cobre, oligossacardeos e
lipdeos conferem diferentes solubilidades s
protenas.
Solubilidade: resultado global das interaes
atrativas e repulsivas entre molculas do
solvente e soluto;

favorecida quando h interaes repulsivas
entre molculas de soluto e atrativas entre
molculas do soluto e solvente;

Interaes entre soluto e solvente so no
covalentes => interaes eletrostticas e foras
de Van der Waals;
pH: grande influncia => altera o grau de
dissociao dos grupamentos;

Carga total zero leva ao da agregao
devido repulso => perfis de solubilidade
em diferentes valores de pH

O ponto de solubilidade mnima igual ou prximo ao
ponto isoeltrico (pI), que corresponde ao valor de pH
no qual a protena possui carga global igual a zero.

pH e distribuio de cargas:
pI
- -
+ +
De modo geral, o solvente aquoso, e, alterando-
se as propriedades do meio por mudanas na
fora inica e no pH, por adio de solventes
orgnicos miscveis e polmeros orgnicos, altera-
se a solubilidade das protenas.
Desnaturao X Precipitao
A desnaturao compreende a destruio da
estrutura terciria de uma molcula de protena e
a formao de cadeias polipeptdicas ao acaso.
- as variveis pH, temperatura e solventes
orgnicos, dependendo dos valores, causam
desnaturao das protenas.
A precipitao compreende a modificao da
estrutura tridimensional da molcula de protena.
- as mesmas variveis, dependendo dos valores,
causam precipitao das protenas.
A precipitao deve permitir que a
conformao adequada da protena
seja recuperada, para que a mesma
possa exercer sua funo bioqumica
aps o processo.
Precipitao por sais
Neutralizao das cargas superficiais com
reduo da camada de hidratao

Salting-out: adio de sais que promovem o
aprisionamento de molculas de gua que
tornam-se escassas e o consequente consumo
das molculas de gua nas regies
hidrofbicas, que expostas interagem e se
agregam.

Os sais mais adequados so aqueles
que apresentam elevada solubilidade,
ex.: citrato de sdio, sulfato de sdio e
sulfato de amnio.
Salting-in: reduo na concentrao de sais
induz interaes inicas e agregao entre
molculas de protena.
Mtodo mais comumente usado para separao
de protenas o da adio de sais neutros
(salting out)
Globulinas se precipitam sob fora inica baixa
Precipitao por solventes

A solubilidade das protenas varia com a distribuio dos
resduos hidroflicos e hidrofbicos na superfcie da
molcula;

lcoois de cadeia inferior, acetona, teres e outros:
precipitantes;

Deve ser miscvel em gua, no reagir diretamente com
as molculas e ser bom precipitante;

Mais usados: metanol, etanol e acetona;
Mecanismo da Precipitao por
Solventes
Agregao de protenas por interaes eletrostticas entre superfcies
com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente
orgnico.

Variveis que afetam o processo
Temperatura: 20 30 C estimulam a
desnaturao < 0 C podem garantir que no
haja desnaturao

adio do solvente temperatura =>
deve ser lenta e sob refrigerao


pH: prximo ao pI favorece a precipitao
Precipitao por polmeros

PEG (polietilenoglicol), polmero de alta massa
molar, neutro e miscvel em gua, disponvel em
diversos graus de polimerizao;

Em geral, propores de polmero (15 a 30%);
4000 g/mol ou mais so os mais eficientes
Mecanismo: excluso da protena do meio
aquoso;
Concentrao depende do tamanho da molcula
a ser precipitada e da massa molar do polmero,
sendo inversamente proporcional
concentrao da protena;
Remoo do polmero: ultrafiltrao, adio de
etanol, separao pela formao de duas fases
aquosas pela adio de sais.
Polieletrlitos: polmeros inicos solveis em gua;
usados devido ao baixo custo e pouca concentrao
residual;
Poliction polietilenoimina e polinion cido poliacrlico,
utilizados para precipitar cidos nuclicos e protenas.
Mecanismo: Ocorre a agregao protena
(floculao) ou eletrosttico (neutralizao de cargas);
a protena e o polieletrlito devem ter cargas opostas ,
por isso, deve-se operar longe do ponto isoeltrico da
protena.
Precipitao pela temperatura
Mecanismo:1) diminuio: reduo na solubilidade;
2) aumento: desnaturao => exposio de grupos
hidrofbicos que interagem e formam complexos
insolveis;
Precipitao isoeltrica

Resulta da atrao eletrosttica das protenas
quando estas esto prximas a seu pI;
Mtodo bastante simples: ajuste do pH
Prximo ao pI a repulso eletrosttica
mnima => precipitao isoeltrica, por
interao entre as zonas hidrofbicas;
Vantagem: baixo custo
Desvantagem: possibilidade desnaturao
Obs.: Mtodo til para precipitar protenas
indesejveis e otimizar outros tipos de
precipitao;
12.5.2 Separao por Membranas
Os processos mais empregados para purificao de bioprodutos
so os que utilizam a diferena de presso como fora motriz;

Em razo da natureza e do tipo de solutos e da presena ou no de
partculas em suspenso, existem diferentes membranas com
diferentes tamanhos e distribuio de poros caracterizando 4
principais processos:

Microfiltrao;
Ultrafiltrao;
Nanofiltrao.
Osmove inversa.
A membrana atua como uma barreira seletiva permitindo a passagem de
determinados componentes enquanto impede a passagem de outros.
Vantagens da Separao por Membranas
Economia de Energia :
Os PSM, em sua grande maioria, promovem a separao sem que ocorra
mudana de fase.

Seletividade :
Em algumas aplicaes estes processos se apresentam como a nica
alternativa tcnica de separao.

Separao de Compostos Termolbeis :
So operados temperatura ambiente, podendo ser aplicados no
fracionamento de misturas envolvendo substncias termossensveis
amplamente empregados na indstria farmacutica e de alimentos.

Simplicidade de Operao e Escalonamento :
So simples do ponto de vista operacional e em termos de
escalonamento(scaleup).
.Os sistemas so modulares e os dados para o dimensionamento de uma planta podem
ser obtidos a partir de equipamentos pilotos operando com mdulos de membrana de
mesma dimenso daqueles utilizadosi ndustrialmente. Alm disso, a operao dos
equipamentos com membranas simplese noi ntensiva em mo-de-obra.
Classificao dos Sistemas :

FORA MOTRIZ : - Concentrao
- Presso
- Potencial Eltrico
- Temperatura
Principais caractersticas dos processos que utilizam diferena de
presso como fora motriz :
Faixas de tamanho de poros das membranas
Microfiltrao
similar a uma filtrao clssica que utiliza membranas
sintticas como barreira seletiva
Emprega membranas microporosas, isotrpicas ou
anisotrpicas, com tamanho de poros entre 0,05 a 5 mm
empregada para reter partculas em suspenso, tanto no
ar quanto em misturas aquosas
So membranas totalmente permeveis aos compostos
solveis, independentemente do valor de suas massas
molares
Aplicao: filtrao estril, tanto de lquidos (mosto)
quanto de gases (ar).
Ultrafiltrao
Emprega membranas microporosas anisotrpicas, com
dimetros de poros entre 1 e 500 nm.

Capaz de reter macromolculas em soluo, e permevel a
todos os solutos de baixa massa molar

O limite de reteno de uma membrana de ultrafiltrao
definido como o valor da massa molar de uma macromolcula
rejeitada em 95% pela membrana

Aplicaes :
-Utilizada na purificao quanto na concentrao de protenas e enzimas
-Indstria alimentciapr concentrao do leite e recuperao de protenas do
soro do queijo,
-Indstria automobilstica e txtil recuperao de pigmentos para reciclo da
gua

Nanofiltrao
Osmose Inversa
Utiliza membranas anisotrpicas densas, portanto, so
permeveis apenas ao solvente, em geral, gua, retendo,
praticamente, todas as molculas solveis e materiais em
suspenso;

Alta presso faz a gua atravessar a membrana no sentido da
soluo mais concentrada para a menos concentrada.


Osmose Inversa
Diafiltrao
12.5.3 Separao por Extrao Lquido-Lquido
Utilizada na purificao de antibiticos e cidos orgnicos;

Consiste na separao da molcula-alvo e impurezas baseada
em suas diferentes solubilidades nas fases lquidas
Vantagens
Sistemas de duas fases aquosas so formados pela
reunio de determinados polmeros, polieletrlitos, ou
polmeros em combinao com solutos de baixa massa
molar formando quatro grupos de combinaes :

2 polmeros no-inicos.
Polieletrlito e um polmero no-inico;
2 polieletrlitos
Polmero no-inico e um composto de baixa massa
molecular
Extrao em sistemas de duas fases aquosas
Sistemas formados por polietilenoglicol e um sal so
intensamente empregados por apresentarem rpida
separao das fases, baixo custo e elevada seletividade na
separao de molculas com base na solubilidade
Extrao em sistemas de duas fases aquosas
Duas solues aquosas
imiscveis;

Molcula-alvo P apresenta
maior solubilidade na fase de
topo em relao fase de
fundo;

Maior grau de pureza da
molcula-alvo se os
contaminantes apresentarem
solubilidade maior na fase de
fundo
Diagrama de Equilbrio em sistemas de
duas fases aquosas (SDFA)
Curva de equilbrio de um sistema PEG/fosfato
Reta TMB: linha de amarrao (tie-line)

Curvas de equilbrio do sistema PEG/fosfato de
potssio em funo dos parmetros massa
molecular e pH do meio
Coeficiente de Partio (K)
Grandeza adimensional que representa a relao entre as
concentraes da molcula de interesse na fase de topo e na
fase de fundo no equilbrio:
K= C
Ti
C
Fi

C
Ti
= Concentrao de soluto i na fase de topo (g/L);
C
Fi
= Concentrao de soluto i na fase de fundo (g/L);

Utilizado para avaliao da extenso das separaes nos sistemas de duas
fases aquosas;
Ocorrncia de purificao: coeficientes distintos para a molcula de interesse
e para as demais molculas.
Fatores que influenciam no coeficiente de partio K
Interaes hidrofbicas
Cargas superficiais / pH
Diferena de potencial eltrico entre as fases
Efeito de salting-out da fase salina
Diferenas de viscosidade
Diferenas de densidade
Diagramas de fases (ex.: concentrao de PEG e sal)
Massa molecular da biomolcula
12.6 Purificao de Alta Resoluo
Concentrao e/ou Purificao de Alta Resoluo consiste na
separao da molcula alvo, em relao a molculas com algumas
caractersticas fsico-qumicas semelhantes, tais como algumas
protenas.

As principais operaes unitrias envolvidas neste processo so :

- Cromatografia de excluso molecular

- Cromatografia de troca-inica

- Cromatografia de interao hidrofbica

- Cromatografia de afinidade

Cromatografia
Princpio Geral:

Reteno e Liberao da molcula-alvo.

A matriz slida capaz de reter a molcula por um
determinado perodo de tempo (tempo de reteno),
normalmente por processo de adsoro.

Eluio do fluido e consequente separao da molcula-
alvo.
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia de excluso
molecular
Processo:

Os solutos de um meio lquido (protenas, peptdeos,
anticorpos) so adsorvidos ou retidos em um leito de
material poroso;

As molculas sofrem partio em virtude das diferenas
no tamanho das espcies entre um solvente (fase mvel)
e uma fase estacionria de porosidade definida;

A posterior remoo gradual dos solutos por ao de
uma fase lquida mvel (eluente), resulta na separao
das diferentes molculas
Cromatografia de excluso molecular
A ordem de recuperao seletiva das molculas no fluxo eluente tem incio
com as maiores molculas, prosseguindo em direo s menores.
Separao por tamanho das molculas
Cromatografia de excluso molecular
Eluio de uma mistura
de trs protenas de
massas moleculares
diferentes em uma coluna
de permeao em gel,
com a formao de faixas
distintas medida que a
amostra permeia a coluna
Cromatografia de excluso molecular
Aplicaes:

Dessalinizao

Determinao de massas
moleculares

Determinao de tamanho de poros
Baseia-se na afinidade que componentes de uma
amostra tem com os stios inicos em uma matriz
slida, ou seja, existe uma competio entre ons de
interesse e contaminantes pelos grupos carregados
da matriz ou da fase estacionria.

As resinas empregadas apresentam elevada
capacidade de adsoro de protenas

A fase estacionria, eletricamente carregada, tem a
capacidade de reter solutos que esto na fase mvel e
apresentam cargas de sinais opostos

Controle de pH e fora inica

Cromatografia de troca-inica
Matrizes de troca-inica:

Trocadores aninicos: contm grupos positivamente
carregados e adsorvem protenas com carga lquida negativa

Trocadores catinicos: contm grupos negativamente
carregados e adsorvem protenas com carga lquida positiva

Aps serem adsorvidos matriz, os solutos podem ser eludos
por deslocamento com outros ons, com a mesma carga da
protena adsorvida, porm com maior fora de interao com a
fase estacionria.

Cromatografia de troca-inica
Princpio bsico da cromatografia de troca inica

Cromatografia de troca-inica
Cromatografia de interao hidrofbica
Baseia-se na reteno das molculas pela interao da
sua regio hidrofbica com a matriz

A protena colocada em meio com elevada
concentrao de sal (expe a regio hidrofbica,
aumentando a interao com a matriz)

Cromatografia de interao hidrofbica

Molcula de protena
Cromatografia de interao hidrofbica

Modelos de adsoro
a: modelo uniponto;
b e c: adsoro uniponto;
d: foras hidrofbicas de intensidades diferentes em razo das irregularidades na
superfcie da matriz.
Tcnica de separao altamente especfica que
depende das interaes entre os pares de
materiais biolgico: enzima-substrato, enzima-
inibidor, antgeno-anticorpo.

O ligante imobilizado em uma matriz porosa
Cromatografia de Afinidade
Cromatografia de Afinidade

Alta especificidade

Separao de formas ativas de formas
desnaturadas Cromatografia de Afinidade

Alta especificidade

Separao de formas nativas de formas
desnaturadas
O complexo formado entre o ligante e a protena tem que ser
reversvel;

A protena eluda e o ligante regenerado.
Cromatografia Ampliao de
Escala
Critrios:

Manter os mesmos graus de pureza, rendimento,
atividade biolgica e, se possvel, rendimento,
alcanados em escala de bancada;

Purificao de miligramas a gramas de produto;

Principal caracterstica: aumento do dimetro da
coluna e a manuteno constante da altura do leito
cromatogrfico, exceto para excluso molecular
(ainda deve ser aumentado em 10 % a altura do
leito);


Parmetros que devem ser mantidos constantes:
Volume da fase estacionria;
Grau de empacotamento;
Altura do leito cromatogrfico;
Velocidade linear de alimentao (vazo volumtrica dividida pela rea de
corte transversal da coluna).

Parmetros que devem ter o valor aumentado:
Dimetro da coluna;
Fluxo volumtrico;
Volume de amostra
Cromatografia Ampliao de Escala
Colunas industriais
Altura de leito em torno de 30 cm e dimetro da ordem de 1 m.
Maiores volumes de colunas da ordem de 700 a 2000 L (ex.: purificao do
soro de queijo)
Cromatografia Ampliao de Escala
12.7 Tratamentos Finais
Operaes para acondicionamento final do produto

- Liofilizao

- Cristalizao

- Secagem