Universidade Federal de Santa Catarina

Centro de Cincias Biolgicas

PPG Neurocincias Neuroqumica I
Prof Roberto Baine Leal

Tatiani de S. Barbosa
O MPTP uma potente neurotoxina com efeitos neurotxicos
em neurnios dopaminrgicos nigroestriatais (IRWIN e
LANGSTON, 1985, OGAWA et al., 1987), produzindo disfunes
cognitivas comparveis s observadas na DP.
Introduo
Disfunes motoras
devido a devido a
perda progressiva de
clulas
dopaminrgicas no
SNpC:
Tremores
Rigidez
Ascinesia
Hiposcinesia
Bradiscinesia
A descoberta deste
composto foi
fundamental para a
compreenso dos
mecanismos que
conduzem
neurodegenerao
dopaminrgica
(Przedborski et al.,
2001). Assim, depois
de uma
administrao
sistemica de MPTP
(molcula altamente
lipoflica), este
atravessa,
facilmente, a
barreira hemato-
enceflica (BHE)
- Embora a MAO-B das clulas gliais parece ser a principal enzima
envolvida na bioativao de MPTP, o citocromo P450 2D6
(CYP2D6), localizado nos neurnios dopaminrgicos da substncia
nigra, parece desempenhar uma atividade importante na
determinao da toxicidade MPTP.
- A CYP2D6 est predominantemente localizada na membrana
microssomal de fraces do fgado, crebro e outros tecidos
perifricos. Vrios estudos tm sugerido concordncia entre o
polimorfismo do gene CYP2D6 e a incidncia da doena de
Parkinson
Cytochrome P450, family 2, subfamily D, polypeptide 6
Demonstrar que mitocndrias marcadas com
CYP2D6 podem catalizar o metabolismo de
MPTP em MPP+
Objetivos
Resultados
Oxidao Mitocondrial do MPTP em MPP+ txico
Verificao da atividade da MAO em mitocndrias em clulas COS 7 em
comparao com mitocndrias cerebrais. Verificou-se que a atividade da MAO total
foi maior nas mitocndrias cerebrais (4 vezes maior que nas mitocndrias em
clulas COS-7). Atividade da MAO A (inibio por clorgilina) nas mitocndrias em
clulas COS, foi 5 vezes maior que a atividade da MAO B (inibio por deprenil)

A anlise imunoqumica do lisado total de clulas,
demonstrou que a protena CYP2D6 foi induzida por Dox
apenas nas clulas transduzidas com WT CYP2D6 cDNA.
Extrato celular a partir de COS-7 expressando WT CYP2D6 tratados com e
sem Doxiciclina (para induzir CYP2d6)

Ensaio de integrao de membrana no ret. endoplasmtico pancretico
canino. Houve avaliao da afinidade de SRP (partcula recombinante)
para o WT. T= produto total do ensaio M= frao protenas ligadas ao RE
da membrana que foram re - isoladas e lavadas.

Aprox 25% de WT CYP2D6 foi marcada para mitocondria

Ambas construes mutantes -SRP e +SRP exibiram um nvel
mais baixo de expresso de CYP2D6 do que WT, embora o +SRP
mutante foi preferencialmente marcado para microssomos, e
SRP mutante foi preferencialmente marcado para mitocondria.






Estes resultados suportam a hiptese que a eficincia de ligao de SRP
um fator limitante na marcao de novas cadeias para microssomos e
mitocndria.

Formao de MPP+ em mitocndria isolada
- Alto nvel de de MPP+
txico

- No foi inibido pelo
controle ascite

- Houve inibio (65%) pelo
anticorpo especfico

- A atividade foi inibida pelo
inibidor especfico de
cyp2d, a quinidina, alm
disso sugerindo que muita
da atividade metablica foi
devido ao cyp2d6.


Oxidao do MPTP por
CYP2D6 purificado
A) - Houve maior oxidao do
MPTP em MPP+, na presena
de CYP2D6 e ADX/ADR

- Na presena de Quinidina
e do anticorpo inibitrio houve
inibio da atividade da
Da CYP2D6

Oxidao do MPTP por
CYP2D6 purificado
B) Deprenil (inibidor da
CYP2D6) em maior
concentrao, inibiu a
oxidao do MPTP.
C,D) Deprenil em
concentraes aumentadas,
tambm inibiu a atividade
de hidroxilao do bufuralol
dos microssomos, e da
CYP2D6 purificada

A inibio da atividade da CYP2D6
por Deprenil no restrita a apenas
um substrato. Embora no
mostrado, Pargilina tambm inibe a
CYP2D6 atividade dependente.
Os resultados demonstram
que CYPD2D6 pode oxidar
eficientemente MPTP em
MPP+ em um Adx/Adr-
supported system
Padro Respiratrio das clulas Neuro- 2 A expressando vrias
formas de CYP2D6
Os nveis de protenas mitocondriais em WT e +SRP
CYP2D6, foram significativamente maiores do que
os que foram demonstrados no sistema lentiviral
induzvel (Fig 1)
Esta diferena pode ser
devido a expresso
constitutiva no sistema
retroviral
B) Os nveis do marcador gnico (mRNA) para puromicina
acetiltransferase foi identificado, sugerindo um nvel similar
de expresso.

C) Os nveis de vetor de DNA integrado foram quase iguais,
sugerindo um nvel similar de integrao genmica e possvel
expresso.
- A anlise do padro respiratrio mostrou que o OCR basal, produo de ATP
e respirao mxima, foram aumentadas em +SRP se comparadas com WT
- O vazamento de prtons para OCR, foi aproximadamente igual em WT. Todos
estes parmetros foram significativamente baixos em SRP2D6.
- A adio de MPTP inibiu OCR basal, produo de ATP e OCR mximo em
todas as clulas, embora o vazamento de prtons tenha sido aumentado pela
adio de MPTP principalmente em SRP 2D6.

Atividade metablica do WT e CYP2D6 mutante.
- Altos nveis de MPDP (7,6 nmol/mg de ptna) e MPP+ (1,3
nmol/mg de ptna) foram encontrados em SRP 2D6
- Estes valores parecem estar prximos dos nveis de
metablitos formados nas mitocondrias cerebrais de
ratos, o qual demonstrou valores altos.
Contedo de Citocromo P450 e atividade metablica
mitocondrial e microssomal em clulas Neuro 2 A.
Para +SRP CYP2D6: o contedo mitcondrial foi aprox 0,27
nmol/mg, microssomal 0,95 nmol/mg

Para SRP CYP2D6: o contedo mitocondrial foi 0,99
nmol/mg, e valores microssomais prximos dos valores para
mock-transfected cells.


B) Valores quase idnticos do nmero de turnover para hidroxilao
do bufurolol;

C) Enzimas mitocondriais a partir de WT2D6 e SRP , apresentaram
turnover comparvel para formao de MPP-
A diferena na atividade das enzimas mitocondriais contra as
microssomais para o metabolismo MPTP em grande parte devido
diferena entre as protenas transportadoras de eltrons, ao invs de
mutaes direcionadas para os domnios de sinal N-terminal.
Efeitos do MPTP na atividade do complexo I e produo de ROS
em clulas Neuro 2 A.
A) Houve nveis aumentados de produo de ROS para todas as
linhagens celulares, a adio de MPTP induziu esta produo.
Estes dados so consistentes vrios estudos que sugerem o efeito
inibitrio de MPTP na respirao mitocondrial.

B) Experimento controle, tratamento com perxido dismutase,
resultados sugerem que estas clulas produzem altos nveis de
O2. A presena de catalase diminui o sinal de fluorescncia.

Os nveis da produo ROS em clulas SRP 2D6, foram
atenuados na presena de quinidina, o que confirma o papel da
mitocndria marcada com CYP2D6 na induo do MPTP para
produo de ROS .
Inibio da atividade do complexo I, em neurnios
diferenciados e indiferenciados.
MPTP inibiu a atividade do complexo I em clulas mock-
tranfected apenas marginalmete, embora a inibio tenha
sido mais notvel (45%) em -SRP
A inibio MPTP mediada, foi alta em SRP, moderadamente alta
em WT e no foi visvel em +SRP
C) A inibio do complexo I foi alta em clulas Neuro 2 A diferenciadas ( aprox
50%)

D) Quinidina e Deprenil resturaram a inibio por MPTP.
A atividade da MAO foi determinada na mitocondria a partir
de clulas fgado de rato, clulas C6 e clulas Neuro 2 A.

Na presena do inibidor a atividade foi diminuda.

i,iii) Houve diferenciao em mock transfected e - SRP em
resposta a adio de cAMP e no de MPTP
ii) A adio de MPTP afetou a diferenciao das mock transfected
cells.
iv) Diferenciao atenuada em resposta a adio de MPTP

O metabolismo de MPTP pela mitocondria marcada com CYP2D6
afeta a diferenciao neuronal.
TH: um marcador para diferenciao de neurnios
dopaminrgicos

i) Tratamento de MPTP em clulas MOCK, reduz os nveis de TH,
o qual no foi aumentado pelo tratamento com quinidina
ii) Quantificao do imonoblot



Efeitos do MPTP na localizao mitocondrial de marcador
de autofagia Parkin
- Tratamento com MPTP de clulas mock
tranfected, produziu aumento marginal na
localizao mitocondrial de Parkin (i)
- o que no foi alterado pelo tratamento
do inibidor de quinidina CYP2D (iii)
- Em SRP 2D6, o tratamento
com MPTP aumentou a
marcao da localizao
mitocondrial da Parkin (ii)

- o qual foi substancialmente
reduzido pelo tratamento com
quinidina (iii)
Estes resultados demonstraram que a atividade metablica da CYP2D6
crtica para o recrutamento de Parkin MPTP induzido, do
compartimento mitocondrial.
Efeitos do MPTP na induo de Drp-1, um marcador de
de fisso mitocondrial
- Os nveis de Drp-1 mitocondrial no controle de clulas mock tranfected
foram relativamente baixo (i)
- Houve aumento pelo tratamento com MPTP (ii)
- No houve efeito no tratamento com quinidina
- Clulas SRP CYP2D6 tambm demonstraram quantidade baixa de
Drp-1 (i)
- Houve aumento com tratamento com MPTP (ii)
- Tratamento com quinidina reduziu os nveis de DRP-1
Efeito do tratamento com MPTP em neurnios primrios em
crebro de camundongos
A) Houve morte celular em
aproximadamente 15% das
clulas, no controle de
clulas no tratadas

B) Aps o tratamento com
MPTP , a quantidade de
morte celular aumentou
para aprox. 25%

C) O inibidor da CYP2D6
(quinidina), reduziu a
morte celular em 25%,
sugerindo que a CYPD6
mitocondrial desempenha
algum papel na morte
celular induzida por MPTP
i , ii) Neurnios
dopaminrgicos TH positivo,
expressando CYP2D6

iii) Tripla colorao de
neurnios dopaminrgicos com
anticorpo CYP2D6 (vermelho),
anticorpo TH (azul) e
Mitotracker green.

Parece que neurnios TH
expressam CYP2D6.
Localizao de CYP2D6 mitocondrial em neurnios
dopaminrgicos primrios.
Efeitos do MPTP em neurnios primrios dopaminrgicos
A) Neurnios dopaminrgicos
TH-Stained sem
tratamento.

B) Neurnios tratados com
MPTP, demonstrando que o
crescimento axonal foi
prejudicado.

C) MPTP +Quinidina
D) MPTP + Pargilina
E) MPTP + Deprenil
Os inibidores demonstraram um
papel protetor?
De maneira geral, os resultados demonstraram


- Controle respiratrio celular alterado;

- Aumento dos nveis da produo de ROS

- Inibio do complexo I nas CYP2D6 mitocondriais, em resposta a
adio de MPTP

- O metabolismo de MPTP pela mitocondria marcada com CYP2D6
afeta a diferenciao neuronal.

- A CYP2D6 pode oxidar eficientemente MPTP.



OBRIGADA!!