Dr.

JULIO HILARIO VARGAS

Departamento de Fisiologa Humana
Facultad de Medicina UNT
Tcnicas de diagnostico inmunolgicas
* Mtodos de laboratorio usando anticuerpos

* Anlisis de estructura y expresin gentica

* Ratones transgnicos y knockout
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos: RIA, ELISA

Purificacin e identificacin de protenas: Inmuno precipitacin,
cromatografa de afinidad

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos:
Citometra de flujo, Inmunofluorescencia e inmuno histoqumica

Anlisis de estructura y expresin gentica
Hibridizacion por Southern blot

Hibridizacion por Northern blot

PCR

Ratones transgnicos y knockout
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos

Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos: RIA, ELISA

Purificacin e identificacin de protenas: Inmuno precipitacin,
cromatografa de afinidad

Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos:
Citometra de flujo, Inmunofluorescencia e inmuno histoqumica
Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos
RADIOINMUNOENSAYO
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Es un mtodo
radioinmunomtrico que se
basa en la formacin
especfica de los complejos
Antgeno-Anticuerpo
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/Radioimmunoassay.html
Tcnica desarrollada por
Solomon A. Berson y
Rosalyn Yalow en 1960
para determinar la
concentracin de insulina
en el plasma sanguneo
Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Se basa en la deteccin de un antgeno (o anticuerpo) inmovilizado sobre una fase slida
mediante anticuerpos (o antigenos) que directa o indirectamente producen una reaccin
cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectrofotometra
La sensibilidad del ensayo y la especificidad de los diagnsticos son de mas del 97%
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
http://www.neb-test.de/
Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
http://thefutureofthings.com/upload/image/articles/2006/biopen/biopen-elisa-schematic.jpg
ELISA
Las placas estn hechas de polipropileno y poliestireno
Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Materiales
usados en
ELISA
Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos
ELISA
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Laboratory, Department of Dermatology. University of North Carolina at Chapel Hill.
ELISA plate reader
Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos
ELISA
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Laboratory, Department of Dermatology. University of North Carolina at Chapel Hill.
Cuantificacin de antgenos por inmunoensayos
ELISA
Hilario-Vargas J, Vitorio I, Culton D, Kirk J, Prisayanh P, Rivitti E, Aoki V, Hans-Filho G, dos Santos V, Qaqish B,
Diaz LA. J Clin Exp Dermatol Res 2014, 5:2.
Analysis of Anti-desmoglein 1 Autoantibodies
in 68 Healthy Mother/Neonate Pairs from a
Highly Endemic Region of Fogo Selvagem in
Brazil
Purificacin e identificacin de protenas
INMUNO PRECIPITACIN (IP)
Es una tcnica para precipitar una protena antignica de una solucin usando un anticuerpo
que especficamente se une a una protena particular. La inmuno precipitacin requiere que
los anticuerpos del complejo se unan a una fase slida para formar un complejo insoluble.
Se usa para aislar una protena particular de una muestra que contiene un pool de protenas
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Hilario-Vargas J, Dasher DA, Li N, Aoki V, Hans-Filho G, dos Santos V, Qaqish BF, Rivitti EA, Diaz LA; Cooperative Group on Fogo Selvagem
Research. Prevalence of anti-desmoglein-3 antibodies in endemic regions of Fogo selvagem in Brazil. J Invest Dermatol. 2006 Sep;126(9):2044-8.
Purificacin e identificacin de protenas
CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Permite separar una molcula particular de una gran cantidad de molculas que se
encuentran en una mezcla tal como la sangre.
El inmuno adsorbente es preparado y la matriz slida puede ser agarosa, sephadex,
derivados de celulosa u otros polmeros.
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

CITOMETRA DE FLUJO
Permite analizar la expresin de las superficies celulares y molculas intracelulares,
caracterizando y definiendo diferentes tipos de clulas en poblaciones celulares
heterogneas, evaluando la pureza de las subpoblaciones aisladas y analizando el
tamao y volumen celular.
Permite el anlisis multiparametro simultaneo de clulas individuales.
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

CITOMETRA DE FLUJO
Mayormente se usa para medir la intensidad de la fluorescencia producida por anticuerpos
marcados que se une a protenas o ligandos marcados en forma especifica
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
FITC: Fluorescein isothiocyanate
Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

Inmuno histoqumica
En muestras tisulares o citolgicas permiten la identificacin de determinantes
antignicos caractersticos de distintas lneas de diferenciacin y funcionalismo
celular.
La aplicacin directa de anticuerpos policlonales o monoclonales sobre secciones
tisulares permite la localizacin microanatmica de su expresin y su correlacin
con los parmetros morfolgicos, aumentando la sensibilidad y especificidad del
estudio y proporcionando informacin adicional esencial en muchos casos.
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Hafner C, Becker B, Landthaler M, Vogt T. Expression profile of
Eph receptors and ephrin ligands in human skin and
downregulation of EphA1 in nonmelanoma skin cancer. Mod
Pathol. 2006 Oct;19 (10):1369-77
Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

Inmuno histoqumica
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos

Inmunofluorescencia
Es una tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos.
Los fluorocromos son molculas que al ser excitadas con la energa de una determinada
longitud de onda son capaces de emitir energa de una longitud de onda mayor.
Mtodos de laboratorio usando anticuerpos
Li N, Zhao M, Hilario-Vargas J, Prisayanh P, Warren S, Diaz LA, Roopenian DC
and Liu Z. Complete FcRn dependence for intravenous Ig therapy in autoimmune
skin blistering diseases. J Clin Invest. 2005 December 1; 115(12): 34403450.
Marcacin y deteccin de antgenos en clulas y tejidos
Gabbi TVB, Bernardelli IM, Santi CG, Maruta CW, Kodani V, Sotto MN, Li N, Hilario-Vargas J, Diaz LA, Rivitti EA, and
Aoki V. Pemphigus foliaceus with neutrophilic spongiosis evolving to an atypical pemphigus phenotype J Am Acad
Dermatol 2004; 51:1012-3.
Anlisis de estructura y expresin gentica
Hibridizacion por Southern blot
Hibridizacion por Northern blot
PCR
La electroforesis es la
migracin de solutos
inicos bajo la influencia
de un campo elctrico.
Las partculas migran
hacia el ctodo o nodo
(electrodos - y +),
dependen de una
combinacin de su
carga, peso molecular
y estructura
tridimensional.
ELECTROFORESIS
Anlisis de estructura y expresin gentica
En electroforesis han sido usados una variedad de
soportes.
Los mas importantes que se usan ahora son los
sistemas de geles de poliacrilamida (Polyacrylamide
Gel Electrophoresis PAGE) y agarosa
Ambos sistemas permiten una variacin en el tamao del
poro del gel, esto es importante para separar o
caracterizar macromolculas por tamao.
La agarosa es particularmente til para grandes
macromolculas debido a que el tamao del poro es mas
grande
ELECTROFORESIS
Anlisis de estructura y expresin gentica
IMPORTANTE
acrilamida y bis-acrilamida son
POTENTES NEUROTXICOS
en disolucin
ELECTROFORESIS
Anlisis de estructura y expresin gentica
ELECTROFORESIS
Instrumentos usados
Dermatologys lab UNC North Carolina
Anlisis de estructura y expresin gentica
ELECTROFORESIS
Fuente: Figure 4-44. Alberts et al.
Molecular Biology of the Cell, 3rd ed
Anlisis de estructura y expresin gentica
BLOT
Anlisis de estructura y expresin gentica
BLOT
ETAPAS
Anlisis de estructura y expresin gentica
Hibridizacion por Southern blot
Anlisis de estructura y expresin gentica
Fue llamada as por que el procedimiento fue desarrollado por Edward M. Southern en los
70s.
Las molculas de DNA son transferidas desde un gel de agarosa sobre un membrana.
Esta diseada para aislar una secuencia particular de DNA en una mezcla. Ej. Localizar un
gen desde el genoma
Anlisis de estructura y expresin gentica
Anlisis de estructura y expresin gentica
Gel coloreado con bromuro
de etidio
L: Marcador de peso molecular. DNA: Extrado de 9 clones de plsmidos
Southern blot. Expuesto a DNA
marcado radiactivamente y
luego rayos X
Representacin esquemtica
del autoradiograma
Hibridizacion por Southern blot
Anlisis de estructura y expresin gentica
Hibridizacion por Northern blot
Tcnica de deteccin de RNA desde una mezcla. Despus de someterla a electroforesis se
marca de forma radiactiva a qumica y realiza la lectura
Anlisis de estructura y expresin gentica
Anlisis de estructura y expresin gentica
Northern Blot de RNA total de cDNA de GLUT 4 humano marcado con P
32
de
pacientes insulino dependientes, no insulino dependientes y controles
Anlisis de estructura y expresin gentica
PCR
Polymerase chain reaction
Anlisis de estructura y expresin gentica
Fue descrita en 1986 por Kary Mullis.
El objetivo es obtener un gran numero de copias de un fragmento de DNA a partir de un
mnimo; tericamente de una sola copia de fragmento original.
Anlisis de estructura y expresin gentica
Anlisis de estructura y expresin gentica
Ratones transgnicos
Son aquellos cuyo material gentico es manipulado con el fin de otorgarle alguna
caracterstica especfica.
Ratones transgnicos y knockout
Ratones transgnicos
Ratones transgnicos y knockout
Ratones knockout
Tcnica que permite crear ratones en los que se suprime un determinado
gen, lo que permite estudiar la funcin del mismo y el efecto de su
ausencia en el desarrollo del animal
Ratones transgnicos y knockout