Les Proteines

Universit DOran
Facult de Mdecine et de
chirurgie dentaire

- Cours de Biochimie -

Dr. Nachi Mourad.
Anne Universitaire 2010-2011
ACIDES AMINES
Objectifs dapprentissage

- tudier la structure des acides amins.

- tudier la forme ionique des acides amins.

- Comprendre les proprits
physicochimiques des acides amins.

Les acides amins, lments
de construction des protines
La base de la diversit des protines
partir de 20 acides amins

Capacit de polymrisation.

Caractristique acido-basique.

Varit des chanes latrales.

Chiralit des molcules.
Les proteines sont une classe de molcules biologiques
macromolcules de premire importance (du grec
proteios).

100 000 protines diffrentes chez lhomme.

Linformation pour fabriquer ces protines est contenue dans
le gnome.

Les protines sont des polymres dacides amines.
La squence en acide amins dtermine la structure primaire
de la protine

Elles sont impliques aussi bien dans les structures des
organismes eucaryotes, protocaryotes et viraux, que dans leur
fonctionnement ( enzymes, transport, anticorps).

Structure gnrale dun acide amin

- Fonction
carboxylique

- Fonction amine

- Chane latrale
H
3
N C H
R
C
O O
Structure gnrale des o-
acides amins
Structure gnrale thorique:
N existe pas en ralit
Forme zwitterionique: prsente
aux valeurs de pH physiologique
ACIDES AMINES - PROTEINES
C
COOH
+
H
3
N H

R

A pH faible cette forme protone de lacide amin
est prpondrante.
CLASSIFICATION
. Les acides amins sont en gnral classs d'aprs les
proprits de la chane latrale en quatre groupes : acide,
basique, hydrophile (polaire) et hydrophobe (apolaire).
Symbole Code 3 lettres Nom

A Ala Alanine

C Cys Cystine

D Asp Aspartate

E Glu Glutamate

F Phe Phnylalanine

G Gly Glycine

H His Histidine

Vingt acides amins diffrents ont t identifis dans les protines, ce
sont les acides amins standards.

I Ile Isoleucine

K Lys Lysine

L Leu Leucine

M Met Mthionine

N Asn Asparagine

P Pro Proline

Q Gln Glutamine

R Arg Arginine

S Ser Srine

T Thr Thronine

V Val Valine

W Trp Tryptophane

Y Tyr Tyrosine
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
3
-C-SH
|-mercaptovaline
(pnicillamine)
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
H-C-COOH
acide |-mthylaspartique
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
2
CH
2
norvaline
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
norleucine
+
H
3
N-CH-COOH
NH
3
+
CH
2
CH
2
CH
2
ornithine
+
H
3
N-CH
2
-CH
2
-COOH
|-alanine
CH
3
-NH-CH
2
-COOH
sarcosine
+
H
3
N-CH-COOH
COOH
CH
2
CH
2
CH
2
acide o-aminoadipique
CH
3
-NH-CH-COOH
CH
3
CH-CH
3
CH
2
N-mthyl-leucine N-mthyl-phnylalanine
CH
3
-NH-CH-COOH
CH
2
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH-CH
3
|-hydroxyleucine
H-C-OH
+
H
3
N-CH-COOH
+
H
3
N-CH-COOH
CH
2
S
CH
2
lanthionine
phnylglycine
+
H
3
N-CH-COOH
acide pipcolique
COOH N
H
acide 4-ctopipcolique
COOH N
H
O
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
3
-C-SH
|-mercaptovaline
(pnicillamine)
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
3
-C-SH
|-mercaptovaline
(pnicillamine)
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
H-C-COOH
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
H-C-COOH
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
2
CH
2
norvaline
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
2
CH
2
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
2
CH
2
norvaline
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
norleucine
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH
2
CH
2
CH
2
norleucine
+
H
3
N-CH-COOH
NH
3
+
CH
2
CH
2
CH
2
ornithine
+
H
3
N-CH-COOH
NH
3
+
CH
2
CH
2
CH
2
ornithine
+
H
3
N-CH
2
-CH
2
-COOH
|-alanine
+
H
3
N-CH
2
-CH
2
-COOH
|-alanine
CH
3
-NH-CH
2
-COOH
sarcosine
CH
3
-NH-CH
2
-COOH
sarcosine
+
H
3
N-CH-COOH
COOH
CH
2
CH
2
CH
2
+
H
3
N-CH-COOH
COOH
CH
2
CH
2
CH
2
CH
3
-NH-CH-COOH
CH
3
CH-CH
3
CH
2
N-mthyl-leucine
CH
3
-NH-CH-COOH
CH
3
CH-CH
3
CH
2
N-mthyl-leucine N-mthyl-phnylalanine
CH
3
-NH-CH-COOH
CH
2
N-mthyl-phnylalanine
CH
3
-NH-CH-COOH
CH
2
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH-CH
3
|-hydroxyleucine
H-C-OH
+
H
3
N-CH-COOH
CH
3
CH-CH
3
|-hydroxyleucine
H-C-OH
+
H
3
N-CH-COOH
+
H
3
N-CH-COOH
CH
2
S
CH
2
lanthionine
+
H
3
N-CH-COOH
+
H
3
N-CH-COOH
CH
2
S
CH
2
lanthionine
phnylglycine
+
H
3
N-CH-COOH
phnylglycine
+
H
3
N-CH-COOH
acide pipcolique
COOH N
H
acide pipcolique
COOH N
H
COOH N
H
O
COOH N
H
O
On retrouve dans la nature des acides amins (400) aux structures
beaucoup plus varies mais qui ne sont pas incorpors dans des
protines.
Acides amins carbone oxygne hydrogne azote soufre
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-R
Chane latrale R
Lacide amin est la brique de base des protines
GLY ALA VAL LEU ILE PRO
SER THR CYS MET ASN GLN
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
non-polaire polaire non charg basique acide
o
R
N
C
O
O
+
carbone
asymtrique
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-H
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
glycine (G)
+
o
ACIDE AMINE A CHAINE AIPHATIQUE HYDROCARBONEE LINEAIRE.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
3
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
alanine (A)
|
+
o
ACIDE AMINE A CHAINE AIPHATIQUE HYDROCARBONEE ET LINEAIRE.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH-CH
3
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
valine (V)
|
CH
3
acide amin essentiel
+
o
ACIDE AMINE A CHAINE ALIPHATIQUE HYDROCARBONEE ET RAMIFIEE.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-CH-CH
3
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
leucine (L)
|
CH
3
+
o
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH-CH
2
-CH
3
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
isoleucine (I)
|
CH
3
+
o
carbone
asymtrique
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-OH

Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
srine (S)
|
+
o
ACIDE AMINE A CHAINE ALIPHATIQUE ET A FONCTION ALCOOL.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH-OH

Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
thronine (T)
|
CH
3
+
o
carbone
asymtrique
ACIDE AMINE A CHAINE ALIPHATIQUE ET A FONCTION ALCOOL.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-SH

Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
cystine (C)
|
+
o
ACIDE AMINE A CHAINE ALIPHATIQUE ET A FONCTION SOUFRE.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-CH
2
-S-CH
3
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
mthionine (M)
|
+
o
ACIDE AMINE A CHAINE ALIPHATIQUE ET A FONCTION SOUFRE.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-C-NH
2
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
asparagine (N)
|
O

+
o
ACIDE AMINE A CHAINE ALIPHATIQUE ET A FONCTION ACIDE.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-C-OH
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
aspartate (D)
|
O

+
o
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-CH
2
-C-NH
2
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
glutamine (Q)
|
O

+
o
Acides amins carbone oxygne hydrogne azote soufre Acides amins carbone oxygne hydrogne azote soufre
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-CH
2
-C-OH

Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
glutamate (E)
|
O

+
o
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-(CH
2
)
4
-NH
3

Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
lysine (K)
|
+
o
+
ACIDE AMINE A CHAINE ALIPHATIQUE A FONCTION BASIQUE.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-(CH
2
)
3
-NH-C-NH
2

Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
arginine (R)
|
NH
2
+
+
o
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
histidine (H)
|
N-H
N
H
H H
+
o
+
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-

Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
phnylalanine (F)
|
+
o
ACIDE AMINE A CHAINE CYCLIQUE ET AROMATIQUE.
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
- -OH

Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
tyrosine (Y)
|
+
o
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
tryptophane (W)
|
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H-
-H
-CH
2
-

N
H
H
+
o
H
N
C
C
O
H
O=
H-
H- -CH
2
Chane latrale R
PHE TYR TRP LYS
ARG HIS ASP GLU
proline (P)
|
CH
2
CH
2
+
o
ACIDE AMINE HETEROCYCLIQUE
Classification des acides amins selon la
polarit de la chane latrale
Acides amins non polaires ou hydrophobes
Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro
Acides amins neutres (non chargs) mais
polaires
Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr
Acides amins acides (chargs (-) pH > 3)
Asp, Glu
Acides amins basiques (chargs (+) pH physiol.)
Lys, Arg, His
Classification des acides amins selon leur importance
alimentaire:
Les acides amins essentiels:
valine, leucine, isoleucine, phnylalanine,
tryptophane, methionine, thronine, histidine
(essentielle pour les nourrissons), lysine,
arginine (semi-essentielle).
Les acides amins non-essentiels:
glycine, alanine, proline, serine, cystine,
tyrosine, asparagine, glutamine, acide
asparagique, acide glutamique.
Nom
Code
1 lettre
Code
3 lettres
Masse
molaire
(g.mol
-1
)
pI
pK
1
(-
COOH)
pK
2
(-NH
2
) pK
R
(-R)
Abondan
ce
relative
dans
Swiss-
Prot (%)
Alanine A Ala 89.09 6.01 2.35 9.87 7.86
Arginine R Arg 174.20 10.76 1.82 8.99 12.48 5.39
Asparagi
ne
N Asn 132.12 5.41 2.14 8.72 4.15
Aspartate D Asp 133.10 2.85 1.99 9.90 3.90 5.34
Cystine C Cys 121.16 5.05 1.92 10.70 8.18 1.51
Glutamat
e
E Glu 147.13 3.15 2.10 9.47 4.07 6.66
Glutamin
e
Q Gln 146.15 5.65 2.17 9.13 3.95
Glycine G Gly 75.07 6.06 2.35 9.78 6.94
Histidine H His 155.16 7.60 1.80 9.33 6.04 2.29
Isoleucin
e
I Ile 131.17 6.05 2.32 9.76 5.91
Leucine L Leu 131.17 6.01 2.33 9.74 9.64
Lysine K Lys 146.19 9.60 2.16 9.06 10.54 5.93
Mthionin
e
M Met 149.21 5.74 2.13 9.28 2.37
Phnylala
nine
F Phe 165.19 5.49 2.20 9.31 3.97
Proline P Pro 115.13 6.30 1.95 10.64 4.81
Srine S Ser 105.09 5.68 2.19 9.21 6.83
Thronine T Thr 119.12 5.60 2.09 9.10 5.41
Tryptopha
ne
W Trp 204.23 5.89 2.46 9.41 1.14
Tyrosine Y Tyr 181.19 5.64 2.20 9.21 10.46 3.04
Valine V Val 117.15 6.00 2.39 9.74 6.73
Une protine de 50 rsidus aura donc une masse molculaire de 50 x 115
= 5750 Da ou 5,75 kDa .La masse molaire de la protine sera
5750. 1,66 10
-24
g/mole.
Quand une protine est forme de 50 acides amins on dit quelle est
compose de 50 rsidus dacides amins car il y a eu formation de 49
liaisons peptidiques et donc dpart (comme on va le voir) de 49
molcules deau. Il ne reste donc que des acides amins dshydrats :
des rsidus.
La masse molculaire moyenne dun rsidu dacide amin est de 115
Daltons (Da).
Le Dalton est une unit de masse qui correspond peu prs la masse
dun atome dhydrogne.
Exprim en g, 1 Da correspond environ 1,66 10
-24
g.
La masse molculaire dun acide amin varie entre 75 Da pour la glycine
et 204 Da pour le tryptophane.
MASSE MOLECULAIRE
JOHN DALTON 1766 - 1844
Les acides amins, lxception du glycocolle, sont
dous dactivit optique, cest--dire quils dvient le
plan de la lumire polarise.

Cette activit optique signe la prsence dans la
molcule dacide amin dau moins un atome de
carbone substitu asymtriquement (C). c'est donc
un centre chiral dont la conformation dfinira les
stroisomres, isomres optiques pouvoir rotatoire
spcifique oppos.
chaque acide amin aura donc deux isomres
optiques.

Pour les acides amins qui possedent plus dun
carbone asymtrique, on aura 2 isomres optiques( :
nombre de carbones asymtriques).
Cas d'acides amins ayant un deuxime centre chiral
Le carbone 3 () de la thronine et de l'isoleucine est aussi un
centre chiral : leur nantiomre (L) existera sous deux formes
pimres. On affecte le prfixe "allo" l'pimre que l'on ne
trouve pas dans les protines :
L Thronine L-allo-Thronine L-Isoleucine L-allo-Isoleucine
Il existe deux isomres de configurations, le D-
amine acide et le L-amine acide, selon que le
groupement amin port par C est droite ou
gauche de la chaine carbone.

D et L acide amin sont limage lun de lautre par
rapport un miroir.les deux streoisomres sont
dits les nantiomres.

Seuls les L-acides amins sont prsents dans les
protines naturels.
Le carbone o est sauf exception chiral et il existe donc des nantiomres : L et D.
Acide et base
Un acide est un compos susceptible de cder un proton
H
+
[donneur de proton(s)].
AH A
-
+ H
+

AH + H
2
O A
-
+ H
3
O
+
en milieu basique La fonction acide s'ionise en librant un proton, la base du
milieu bloque l'ionisation du groupement amine. L'acide amin se trouve sous
forme d'anion.

Une base est un compos susceptible de capter un proton
H
+
- [accepteur de proton(s)].
A
-
+ H
+
AH
A
-
+ H
2
O AH + OH
-

en milieu acide : La fonction amine s'ionise en captant un proton et la
dissociation du carboxyl est inhibe. L'acide amin se trouve sous forme de
cation.
Les acides amins possdent au moins deux
groupement ionisables, le groupement COOH et le
groupement NH2 primaires ( ils sont amphotres).
Les aminoacides en solution pH neutre se trouvent sous forme dions
dipolaires ou zwitterion.
C
COO
+
H
3
N H

R

-
Ltat dionisation dun aminoacide dpend du pH du milieu.
fonction
acide
COOH COO
-
+ H
+
fonction
amine
NH
3
+
NH
2
+ H
+
Cette fonction est dite basique puisquelle ne libre son proton que
pour de faibles concentrations de H+ dans le milieu.
Les zwitterions en milieu acide
H
3
N C COO
H
R
H
3
O
H
3
N C COOH
H
R
H
2
O
Le groupement -COO
-
acquire un proton
Charge globale de l acide amin positive
Les zwitterions en milieu
basique
H
3
N C COO
H
R
OH
H
2
N C COO
H
R
H
2
O
Suite l ajout d une base plus forte que NH
3
comme NaOH
Le groupement -NH
3
+
donne son proton
Charge globale de l acide amin ngative
COOH COO
-
+ H
+
Constante dquilibre
Ka =
[H
+
] x [COO
-
]
[COOH]
1 1
[COOH]
[COO
-
]
[H
+
]
Ka
= x
1 1
[COOH]
[COO
-
]
[H
+
]
Ka
= +
log log log
pH = pKa +
[COOH]
[COO
-
]
log
quation
dHenderson-
Hasselbalch
fonction
acide
Constante dquilibre
NH
3
+
NH
2
+ H
+
Constante dquilibre
Ka =
[H
+
] x [NH
2
]
[NH
3
+
]
quation
dHenderson-
Hasselbalch
1 1
[H
+
]
Ka
= x
[NH
2
]
[NH
3
+
]
1 1
[H
+
]
Ka
= +
log log log
[NH
3
+
]
[NH
2
]
pH = pKa + log
[NH
2
]
[NH
3
+
]
fonction
amine
Constante dquilibre
En allant du PH trs acide au PH alcalin:
~ 2-3 ~ 9-10
pH
Forme
majeure
pH 1
Forme
majeure
pH 7
Forme
majeure
pH 11
Co COOH
NH
3
+
H

R

Co COO
-
NH
3
+
H

R

Co COO
-
NH
2

H

R

pKa
1
pKa
2
50/50 50/50
Lacide amin perd successivement deux protons(diacide);
il se caractrise par deux canstantes dionisations et par consquent
deux PK( PK1 et PK2).
Le PK1 est compris entre PH2 et PH3, il correspond la dissociation
du groupement COOH.
Le PK2 est au voisinage de PH10, il correspond la dissociation du
groupement NH3.
Entre ces deux PK se situe le point isolctrique ou Phi pour le quel
les charges + et sont en quilibre: la charge globale est gale 0.
Au Phi , la charge de lacide amin est nulle; lorsquil est plac dans
un champ lectrique, il ne migre pas.
Si PH PHi : lacide amin est charg positivement et il migre vers la
cathode.
Si PH> Phi : lacide amin est charg ngativement et il migre vers
lanode.

Phi =
PK1 + PK2
2
En cas dun acide amin acide ou basique: troisime PK qui
correspond au PK du groupement radical (PKr) ou (PK3).
Si cest un acide EX: acide apartique: Phi = PK1 +PKr / 2
Si cest une base EX:lysine, arginine: Phi = PK2 + PKr / 2
pK
COOH
pK
NH3
+
1

q
u
i
v
a
l
e
n
t

1

q
u
i
v
a
l
e
n
t

1
/
2

q

Co COOH
NH
3
+
H

CH
3
Co COO
-
NH
3
+
H

CH
3
Co COO
-
NH
2

H

CH
3
1 2 3
1
100%
2 100%
3 100%
pH
Volume
NaOH
1
0
1

q
u
i
v
a
l
e
n
t

pH = pKa + log
[A]
[AH]
pI

1
2
50%
50%
2
3
50%
50%
Exemple : alanine Comment dterminer exprimentalement ces
valeurs de pKa ?
Courbe de
titration de
la glycine
| |
| |
|
|
.
|
\
|
+ =
HA
A
log p pH
-
K
( )
j i
K K I p p 2 / 1 p + =
les aminoacides n'absorbent pas la lumire visible,
leurs solutions sont incolores.
Les acides amins aromatiques absorbent dans
lU.V. entre 260 et 280 nm. Au dessus de 260 nm,
la plus grande partie de l'absorption ultraviolette
des protines provient de leur teneur en
tryptophane et parfois en tyrosine

La phenylalanine absorbe dans la bande des
260nm.

La tyrosine et la tryptophane ont un maximum
dabsorption vers 280nm.
Solutions de tryptophane, tyrosine et phnylalanine 1 mM
Cys
S-S
248 345
Trp
Tyr
Phe
278
275
258
5600

1340
195
max
(nm) c (M
-1
.cm
-1
)
Trp
Tyr
Phe
220 240
260
280
300
0
1
2
3
4
5
6
Longueur donde (nm)
D
e
n
s
i
t

o
p
t
i
q
u
e

-C-NH-
O
His
<200
211
ABSORPTION U.V.-visible
On dtecte trs souvent la prsence de protines dans un milieu par
mesure de la D.O. 280 nm.
-le double groupement fonctionnel commun qui peut s'ioniser

et donc favoriser la dissolution

-les proprits de la chane latrale qui peut avoir un

caractre plus ou moins polaire ou apolaire. : la solubilit

augmente si ce radical R est porteur de fonctions polaires

(NH2, COOH) ou hydrophiles (OH).
SOLUBILITE
La plupart des acides amins subissent facilement

la solvatation par les solvants polaires tels que l'eau,

ou l'alcool. Faible dans les solvant organiques
Le point de fusion est lev> 200c .
Par un alcool en prsence dun acide fort.
+ R-OH R- CH- COOR + H2O
NH2
ACIDE AMINE
ALCOOL
ESTER
Le carboxyle peut former des amides avec les amines.

Asparagine et glutamine sont deux exemples de drivs
physiologiques forms suivant cette raction.
Cette raction est prsente dans les organismes

vivants pour produire partir des aminoacides

des drivs (amines biologiques) qui peuvent

tre des prcurseurs d'autres molcules et ce

par des dcarboxylases spcifiques.

.
Peut tre utilis pour le dosage des acides amins par

la mesure du CO2 dgag
- Srine dcarboxyle en thanolamine : prcurseur de la choline

des phospholipides.

- histidine dcarboxyle en histamine : vasodilatateur intervenant

dans les ractions d'allergie ou d'inflammation.

-acide glutamique dcarboxyle en 4-aminobutanoique ou "GABA" :

un neurotransmetteur.

- 5OH tryptophane dcarboxyle en srotonine : hypertension .

Quelques produits de dcarboxylation d'aminoacides
Action dune base sur COOH.
ACIDE AMINE
+ KOH
Base
R - CH COOK + H2O
NH2
SEL
Les fonctions -amins des aminoacides ragissent

rversiblement avec les aldhydes pour donner des bases

de Schiff qui apparaissent trs souvent comme

intermdiaires dans des ractions enzymatiques impliquant

les aminoacides.
La proline qui contient une fonction amine secondaire

ne ragit pas avec les aldhydes.
ADDITION DE CARBONYLE
Par lacide nitreux HNO2
+ HNO2 R CH COOH + N2 + H2O
OH
ACIDE AMINE
ACIDE NITREUX
ACIDE ALCOOL
DOSAGE DES ACIDES AMINES PAR LA MEURE DU N2 DEGAGE:
METHODE DE VAN SLYKE
Dcarboxylation et Dsamination oxydative:
Certains oxydants attaquent l'acide amin et ralisent une

dsamination associe une dcarboxylation.

La raction avec la ninhydrine est l'une des plus connue

et utilise, elle aboutit un chromophore violet pour les amines

Primaires(570nm) ou jaune pour les amines secondaires (440nm).

Non spcifique :d'autres composs ayant des groupements

amines libres : glucosamine, peptides et protines.

La ninhydrine (2,2-dihydroxyindan-1,3-dione) ;

compos aromatique utilis comme rvlateur

des acides amins
Au cours de la raction il y a production de CO2, de NH3

et d'un aldhyde ayant un atome de carbone de moins que

l'acide amin dont il provient, avec formation de ninhydrine

rduite ( HYDRINDANTINE).
Action du 1fluoro2,4 dinitrobenzene.
il se forme un dinitrophnyl-acide amin color, donc dosable.
Cette raction peut se produire lorsque l'acide amin est
incorpor dans une protine. Si l'on hydrolyse une protine
on libre des acides amins et des DNP acides amins
correspondant aux acides amins dont les groupes NH2 sont
libres dans la protine (terminaux).
NaHCO
3
pH alcalin
Le DNP-aa est un driv de couleur jaune, non hydrolysable

en milieu acide, qui peut tre doss par spectrophotomtrie

360nm et identifis par chromatographie.

le NaHCO
3
permet de neutraliser lacidit due au HF form.
+ HF
Elle a lieu avec les isocyanates, en particulier

le phnylisothiocyanate (PITC).

Le PITC est particulirement utilis pour dterminer

l'enchanement des acides amins dans les peptides :

analyse par rcurrence des squences peptidiques.

Le phnylthiocarbamyl-aminoacide (PTC-AA) rsultant est

un compos caractristique de chaque acide amin (nature

du groupement R). Il est trs stable et dtectable

dans l'ultraviolet (245 nm).
Dans le cas d'un peptide de n aminoacides, le PTC-peptide va subir

une cyclisation et une coupure un pH lgrement acide, librant

un phnylthiohydantoine-aminoacide identifiable

(PTH-aminoacide), qui absorbe dans l'UV, et un peptide de (n-1)

aminoacides.
Action du chlorure de dansyl avec les fonctions amins

Drivs sulfonamides trs fluorescents.

Elle est100 fois plus sensible que la raction de Sanger.
Le DNS-aa est un driv de couleur jaune clair, non
hydrolysable en milieu acide. fluorescent sous U.V.
dtection sur plaque CCM.
- HCL
Donne des drivs extrmement fluorescents.

Proprits utilises pour le dosage des acides

amins, lanalyse squentielle des peptides et

la rvlation des acides amins en chromatographie

sur couche mince.
O
O
O
O
+ R----NH2
H2O
PH 8-9
Fluorescamine
COOH
R--N
OH
O
Compos trs fluorescent
Cest lunion de deux acides amins par liaison covalente
entre le groupe carboxylique dun acide amin et
amin de lautre acide amin pour former une amide
secondaire.
+
H
3
N-C-C
H
O
-
O
R
+
H
3
N-C-C
H
O
-
O
R
+
+
H
3
N-C-C
H
O
-
O
R
+
H
3
N-C-C
H
O
-
O
R
+
H
3
N-C-C
H
O
-
O
R
+
H
3
N-C-C
H
O
-
O
R
+
H
2
O H
2
O
+
H
3
N-C-C-N-C-C
H
O
-
O
R
H
R
H
O
+
H
3
N-C-C-N-C-C
H
O
-
O
R
H
R
H
O
liaison peptidique
La liaison peptidique est trs stable (> ester).

Lhydrolyse ncessite des conditions drastiques :

HCl 6N, 110C, 24h.
Lenchainnement des acides amins dcrit un peptide.

On distingue:

DIPEPTIDE: deux acides amins.
TRIPEPTIDE: trois acides amins.
OLIGOPEPTIDE: plus de quatre acides amins.
EX: SOMATOSTATINE(14AcA).
POLYPEPTIDE: quelque dizaine dAcides amins.
EX:ACTH(39 AcA).
PROTEINES: Macromolcules contenant plus de 50
rsidus dAcA faites dune ou plusieurs chaines.
Ex HEMOGLOBINE(4).
Quelques exemples de peptides dintrt
Vasopressine
Hormone peptidique post-hypophysaire
Agit sur le rein en provoquant la rtention deau (vasoconstricteur).
Tyr

Phe-Gln

Asn

Cys

Cys-Pro-Arg-Gly-cooH

S-S
N-term.
C-term.
Ocytocine
Tyr

Ile-Gln

Asn

Cys

Cys-Pro-Leu-Gly-cooH

S-S
N-term.
C-term.
Agit sur la contraction des muscles lisses

en particulier lutrus lors de laccouchement.
Un acide amin engag dans une chaine peptidique
sappelle rsidu,porte le nom de lacide amin dont il
drive additionn du suffixe -yl-.
La formule dun peptide sscrit en commencant
partir de la gauche par le rsidu ayant son
groupement amin (N-terminal) libre et se termine
par le dernier rsidu droite, celui dont le
groupement carboxylique (C-terminal) est libre, et
porte le nom de lacide amin sans modification.

EX : Leucyl-glycyl-alanine.
La squence est oriente en partant de l'acide amin

N-terminal (extrmit NH2) vers le C-terminal

(extrmit COOH) qui correspond au sens

de la synthse des protines.
Dans des tudes par des rayons X de peptides
cristalliss, PAULING et COREY ont trouver que:

La liaison du carbone carbonyle avec l'azote dans la liaison peptidique

(1,32 )

est plus courte que la liaison simple C -N (1,49 ) mais plus longue

qu'une liaison double C=N classique (1,27 ).
Cela sexplique par le faite que cette liaison peut se trouver
sous deux formes de rsonances : 70% sous forme simple et
30% sous forme double.
Ce caractre de double liaison entrane une certaine rigidit et
empche la libre rotation.
la configuration trans est la plus stable car minimisation de
lencombrement strique des rsidus.
Le caractre partiellement double de la liaison peptidique empche

la rotation autour de la liaison C-N. (entre latome de carbone

du carbonyle et latome dazote de lunit peptidique.

Il existe cependant une libert de rotation autour des liaisons

Ca-C et N-Ca.
La liaison peptidique est plane cest--dire que les 6
atomes attachs au groupement C-N sont localiss
dans un mme plan (coplanaires).

les 2 carbones C se placent de part et d'autre du
pont C-N dans la configuration trans (C..d sur des
cotes opposs de la liaison peptidique).

de part et d'autre de cette structure rigide, les
rotations des groupes des liaisons C-N etC-C sont
libres et seulement limites par l'encombrement
strique.

FORMATION DUN COMPLEXE COLORE AVEC LE CUIVRE
Les liaisons peptidiques sont capables de former un
complexe color avec le cuivre en milieu alcalin
(raction du Biuret).

Ce complexe prsente un maximum dabsorbance de la
lumire 650 nm.

Cette coloration est exploite en spectrophotomtrie
pour le dosage des protines.
Complexe color entre Cu2+ et les groupements
carbonyles ainsi que les lments azote de 2
liaisons peptidiques successives par le biais de
liaisons lectrostatiques.
Correspond l'ordre d'enchanement des acides
amins. La squence est donne en partant de
l'acide amin N-terminal (extrmit NH2) vers le
Cterminal (extrmit COOH) qui correspond au
sens de la synthse des protines.
ALA-CYS-ASP-GLY-SER
Mais sous linfluence des forces attractives ou
rpulsives qui se manifestent tout au long de la
chaine linaire daminoacides, la protine ne
conserve pas cette structure initiale et subit trs
vite une volution tridimentionnelle en structure
secondaire, tertiaire et quaternaire.

Cette volution tridimentionnelle conduira
finalement une conformation spatiale bien
dfinie: la protine native.
Correspond un arrangement rgulier des acides
amins selon un axe. Il existe deux types
principaux de structure secondaire:

* HELICE .

* FEUILLET B.
- elle est caractrise par l'enroulement des liaisons
peptidiques autour d'un axe (arrangement
hlicodal).
Cet enroulement se fait vers la droite qui est
privilgi par la configuration L des
aminoacides(hlice droite) et comporte 3,6 rsidus
par tour(chaque rsidu est dispos parraport au
suivant selon une translation de 1,5 le long de
laxe de lhlice et une rotation de 100).
- Les rsidus se retrouvent la priphrie ce qui
minimise les encombrement striques. Cette
structure est stabilise par des liaisons hydrognes (
la liaison hydrogne est de 2,8 de long)entre les
groupements CO et NH de 2 liaisons peptidiques
superposes(le groupe CO de chaque acide amin
est li par liaison hydrogne au groupe NH de lacide
amin qui est situ quatre rsidus plus loin dans la
squence linaire).
- Le pas de lhlice est de 5,4 pour les
protines globulaires et de 5,1 pour les
protines fibreuses.
- Tous les groupes CO sont orients
presque paralllement vers lavant de
la squence et tous les groupes NH
vers lamont.
3,6
rsidus
- les 2 chanes sont disposes paralllement l'une
l'autre et orientes soit en sens inverse (Nt-
>Ct/Ct->Nt) (antiparallle )soit dans le meme sens
(parallles).
- Les Chanes sont relies entre elles par des
liaisons hydrognes (intra ou interchaines) entre les
CO et les NH de deux liaisons peptidiques
superposes.

Cest une structure plat, tire et etale.
Cest le rsultat de lassemblage des formes
lmentaires de type ou B selon les trois
direction de lespace et par le pliage des chaines. le
tout tant stabilis par des interactions de type non
covalents(liaisons ioniques, liaisons hydrognes,
liaisons de vanderwaals) et des ponts disulfures.
On a quatres types de motifs: le tout , le tout
B,l/B
et l+B .
La structure tertiaire dune protine globulaire se
prsente comme une succession de rgions
ordonnes,soit en hlice , soit en feuillet B, runis
par des zones non ordonnes appeles coudes.

COUDE
Cest un court gment peptidique de 2 4 rsidus.
Une ou deux liaisons hydrognes se forment entre
le premier et le dernier rsidu du coude.
La configuration de la proline est telle quelle
provoque un changement de direction et peut donc
tre presque elle seule un coude.
Les liaisons ou interactions entre chaines latrales des rsidus
impliques dans la structure tertiaire des protines
Pont disulfure
Interactions
hydrophobes
Liaison hydrogne entre
chaines latrales
Pont salin
Attraction
lectrostatique
C-terminal
N-terminal
Tout
/
De plus pour ce type de structure (structure
globulaire), les rsidus d'acides amins apolaires
qui se trouvaient trs loigns les uns des autres
dans la squence vont se trouver trs proches en
raison des repliement et se trouver ainsi
prfrentiellement au centre de la structure o ils
peuvent s'associer par liaisons hydrophobes de
Kauzmann(ala,val,Ile,Leu,Phe,Trp)et crer ainsi une
rgion indispensables au fonctionnement de la
protine(site actif des enzymes Zone hydrophobe
interne qui assure en grande partie la stabilit
gnrale de la molcule ). Tandis que les rsidus
polaires ou ioniques se situent la priphrie o ils
peuvent s'associer entre eux par liaison hydrogne
ou ionique,ou encore avec l'eau par liaison
hydrogne et divers composs protiniques ou non
grace leurs chaines latrales polaires:
* Les metaux : -le fer dans la catalase et peroxdase.

-le zinc dans la glutamate
dshydrognase du foie et la phosphatase alcaline.

* Coenzyme: dans le cas des enzymes qui fon ctionnent
avec un coenzyme spcifique.
Lensemble forme ce quon appele un PELETON.
Une structure tertiaire nest pas une structure fige : elle peut se modifier

se tordre, se dformer sous leffet de la fixation dune molcule (ligand)

ou sous leffet de la variation dun paramtre physico-chimique (pH, temprature).
EX: structure de la myoglobine
DNA polymrase
Bactriorhodopsine
Immunoglobiline
Cest lassociation de plusieurs chaines peptidiques
identiques ou non pour donner un complexe stable
et actif.
Les chaines qui contituent ce complexe sont des
protomres ou sous units.chacune ayant une
structure tertiaire dfinie.
Lassociation des diffrentes chaines se fait via des
liaisons faibles et parfois aussi via des ponts
dissulfures.
ATTENTION
Toutes les protines n'ont pas
ncessairement de structure IV
aire
.
La structure quaternaire nest pas une organisation
immuable:cest un tat dquilibre entre
lassociation et la dissociation partielle des
protomres, cet tat dquilibre est sousmis
laction des facteurs extrieurs la molcule
appels facteurs allostriques.
On parle de transitions allostriques entre la forme
relache ou forme R inactive et la forme
tendue ou forme T active modification de
la conformation.
acides
amins
La structure primaire de la protine :
Squence de la chane dacides amins
La structure secondaire de la protine :
Liaisons hydrogne entre les acides amins
La structure tertiaire de la protine :
Liaisons entre les structures secondaires
feuillet
plisss |
hlice o
La structure quaternaire de la protine :
Association de plusieurs chanes
polypeptidiques
feuillet
plisss |
hlice o
Lhmoglobine est le pigment respiratoire
responsable chez lhomme, les animaux
superieurs, et divers invertbrs du trasport de
loxygne depuis le milieu exterieur jusquau
niveau cellulaire.ce role est du sa capacit de
former avec loxygne une combinaison chimique
facilement dissociable.
Lhmoglobine rsulte de lunion dune fraction
non protinique appele Hme avec une fraction
protinique dite Globine.
LA GLOBINE
Est lassociation de quatre chaines polypeptidiques.
Il existe diffrents types de chaines polypeptidiques rencontres dans
lhmoglobine humainequi diffrent par le nombre des acides amins et
la nature des acides amins N-terminaux: chaines , , y,s et les
chaines (embrionnaires).
HEMOGLOBINE A1: pricipale hmoglobine de ladulte: 2chaines+ 2chaines
HEMOGLOBINE A2: 2% hmoglobine de ladulte: 2 chaines + 2chaines
HEMOGLOBINE F : 2 chaines + 2chaines y

HEME
Cest une porphyrine, structure ttrapyrolique centre
sur un atome de fer.
Chaque chaine est unie une molcule dhme par
lintermediaire de son atome de fer, et don c il existe
04 sites de liaison loxygne dans une molcule.
Le fer a six liaisons de coordinance:
quatres liaisons avec 4 atomes dazote du noyau
ttrapyrolique de la porphyrine.
La cinquime liaison avec latome dazote du rsidu
histidyl proximal (en 63) de chaine polypeptidique.
La sixime liaison reste disponible pour sunir soit
loxygne(oxyhmoglobine), leau ou loxyde de
carbone(CO) dont laffinit pourlhme est 150 fois
plus importante que celle de loxygne.
HEME
Au total deux chaines , deux chaines et
quatre noyaux porphyriniques avec quatre
atomes de fer sassocient en structure
tridimentionnelle.
|2
|1
o1
o2
porphyrine
porphyrine
porphyrine
porphyrine
Hmoglobine humaine (o
2
|
2
)
PROTEINES FIBREUSES
Elles sont galement appeles sclroprotines.

Elles ont une forme allonge.

Elles sont pratiquement insolubles(riches en AcA
Hydrophobe).

On remarque labsence de coude dans leur structure.

Il sagit essentiellement de protines de structure.

rsistance et/ou lasticit.
TYPE TYPE
Kratine naturelles.
Myosine.
Fibrinogne.

* Le pas de lhlice est
de 510 pm.
Fibrone de la soie.
Par tirement de 30%
de la Kratine.

Enroulement de multiples brins
hlicoidaux en une super hlice pour
donner ensuite des cordages rsistants.
EX: Kratine et le collagne
EXEMPLES
Cheveux, la laine, les plumes, les ongles, les
griffes, les cailles ..ect.
Riche en AcA Hydrophobe: Ph,Isoleu,Val et Ala.
La rsistance de la Kratine est amplifie par
lenroulement
de multiples brins hlicodaux en une super hlice.
Le collagne est trs rpandu dans le rgne animal. Cest la principale protine
des tissus conjonctifs(tendons , cartilage et la corne de loeil) et du squelette
des vertbrs.
Le collagne forme des fibrilles qui rsistent la traction.
La molcule de collagne est constitue de 3 chanes peptidiques, dont deux au
moins sont les mmes dans tous les diffrents collagnes.
Ce sont des cylindres denviron 3 x 1000 acides amins, de 280 nm de longueur
et 1,4 nm de diamtre, avec une masse molculaire proche de 300 kDa.
LE COLLAGENE
La squence du collagne comporte des sries de triplets o la glycine occupe la
mme position. Des zones polaires sparent ces squences :
Gly-Ala-Pro Gly-Pro-Ala Gly-Pro-Pro(OH)
Les rsidus de Pro et Pro(OH) imposent une conformation hlicodale (droite),
avec un triplet dans chaque spire, sans liaison hydrogne.
La structure spatiale est complte par la formation dune triple hlice
( Tropocollagne) grce, cette fois-ci, ltablissement de liaisons H inter-
chanes nombreuses, et aussi la prsence de glycine, qui se trouve lintrieur
de la triple hlice.
Chacune d'entre elle se prsente comme une
hlice gauche trois rsidus par tour
(analogue la structure PolyPro II et
polyGlyII).
Retrouv dans le tissu conjonctif lastique
dont lunit de base est la tropolastine.
Riche en Gly-Ala et surtout en rsidus Lys.
Protines fibrillaires responsables de la
contraction musculaire.
PROPRIETES DES PROTEINES
SOLUBILITE
SOLUBILITE
INFLUENCE DU PH
La solubilit dune protine est minimum pour une valeur de pH gale
son phi, car ce pH la protine se comporte comme une molcule
neutre et ses possibilits dinteraction avec leau par le biais de liaisons
hydrognes sont donc minimum.
SOLUBILITE
INFLUENCE DE LA FORCE IONIQUE
Les sels interviennent la fois par leur charges
et leur concentrations.

U= c.z
*C: concentration de chaque ion.
*Z: valence de chaque ion.

Les protines sont solubles faible force ionique,
alors qu force ionique leve(concentration en
sels augmente) les protines prcipitent : cest
leffet de relargage: utilis dans les techniques
de prcipitation par les sels: sulfate
dammonium.

2
EXPLOITATION DU PHNOMNE DE
RELARGAGE PAR LES SELS
Plus une molcule est polaire, plus la force ionique devra tre importante
pour observer le phnomne de relargage par les sels.

Pour une force ionique donne, certaines protines pourront tre encore
solubles alors que dautres auront dj t prcipites.

Ce principe est couramment utilis lors des premires tapes de purification
dune protine pour sparer rapidement et moindre cot les protines des
autres composants prsents dans le milieu.

Il est galement envisageable dexploiter le phnomne de relargage par les
sels afin de sparer des protines.
SOLUBILITE
INFLUENCE DE LA TEMPERATURE
Llvation thermique est un facteur de dnaturation des
protines et par consquent de leur prcipitation.
En dessous de 40, la T favorise la solubilit de
certaines protines.
La dnaturation dune protine correspond la
destruction des liaisons qui maintiennent en place les
niveaux de structure quaternaires (sil y a lieu), tertiaires
et secondaires.
La protine se prsente sous une configuration
dsordonne, seule la structure primaire nest pas
perturbe. En consquence, la protine nest plus sous sa
forme native et a donc perdu son activit biologique.
Suivant les facteurs de dnaturation, le processus peut
tre rversible ou irrversible.
SOLUBILITE
INFLUENCE DES SOLVANTS ORGANIQUES
Les protines sont insolubles.

Augmentent les forces dattraction et
facilitent ainsi lagrgation des protines
entre elles.
SOLUBILITE
INFLUENCE DES DETERGENTS
Pntrent dans le cur des protines et
perturbe les interactions hydrophobes.
le dsoxycholate de sodium qui facilite le
passage en solution de certaines protines
enzymatiques.
SOLUBILITE
INFLUENCE DES AGENTS CHIMIQUES
Ure et Guanidine:

Facilitent la pntration de leau dans les protines, ce qui perturbe

les interactions hydrophobes et les liaisons hydrognes.

Mercaptothanol entrane la rupture des ponts disulfures.

Lacide trichloractique 5% provoque la prcipitation des protines.
CARACTERE AMPHOTERE
Les protines possdent au moins deux fonctions caractre acido-
basique (extrmits N et C terminales), elles ont donc un caractre
amphotre.
La charge globale dune protine sera fonction du bilan des charges
prsentes sur chaque site acido-basique.
Cette charge globale pourra tre positive, nulle ou ngative.
La protine pourra, en fonction du pH du milieu dans lequel elle se
trouve, se comporter comme un cation, comme une molcule neutre
ou comme un anion.
Le pH ou 100 % de la protine est sous forme globalement neutre
(forme zwitterion) correspond au pHi de la protine.
Lorsque le pH est infrieur au pHi, la forme majoritaire de la protine
est la forme cation.
Lorsque le pH est suprieur au pHi de la protine la forme majoritaire
de la protine est la forme anion.
ESTIMATION DU PHi DUNE
PROTINE
Le pHi dune protine dpend du pKa de chaque fonction
acido-basique.

Sachant que le pHi correspond au pH o la protine est
entirement sous la forme zwitterion, on peut facilement
estimer sa valeur par une quation du type:

pHi = 1/2 (pKa1 +pKa2) avec pKa1 et pKa2 correspondant
aux pKa des couples acidobasiques impliqus dans la
formation de la forme zwitterion.
Le bilan des charges montre que la forme zwitterion
(charge globale de la protine gale 0) est majoritaire
entre pH 3,86 et pH 9,69.
On aura une valeur proche de 100 % de forme zwitterion
entre ces deux pH.

On peut donc estimer le pHi de cette protine :

pHi 1/2 (3,86 + 9,69) 6,775

METHODES CHROMATOGRAPHIQUES.

METHODES ELECTROPHORETIQUES.

DOSAGES SPECIFIQUES.
CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER.
CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE.
CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE.
CHROMATOGRAPHIE SUR ECHANGEUR
DIONS.
Les protines: purification

La chromatographie est une technique de sparation qui utilise un support
qui possde des proprits physico-chimiques particulires.

Ce support va retenir les protines en fonction de critres variables.
- en fonction de la charge des protines.
- en fonction de leur affinit pour des molcules (ligands).
- en fonction de leur taille.

Chromatographie sur colonne:
rservoir
colonne
phase stationnaire
Solvant
(phase mobile)
collecteur

Chromatographie dchange dions:
La phase stationnaire est compose dune rsine qui peut tre

- charge positivement (changeuse danions)

- charge ngativement (changeuse de cations)

Les interactions molcules-colonne vont dpendre de la charge des
molcules. Ces interactions pourront tre modules par le pH et la force
ionique (concentration en sels) du milieu.
CH
2
C
O
O
CH
2
SO
3
-
C
2
H
4
N
+
C
2
H
4
C
2
H
4
H
Exemple dune purification par change de cations: sparation de
3 acides amins Ser, Asp et Lys
- tape 1: la colonne (charge ngativement) est quilibre avec
une solution faiblement concentre en sels.

Les cations de la solution (ici Na+) vont se fixer sur les charges
ngatives de la phase stationnaire.
SO
3
-
Na
+
Bille de rsine

- tape 2: la solution contenant le mlange des molcules sparer est
dpose sur la colonne.

Ce sont les molcules prsentes en plus grande concentration qui se
fixent la colonne.
Ici, les groupement chargs positivement vont se fixer la colonne la
place des ions Na
+
Asp
Lys
Ser
CH
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
NH
3
+
COO- NH
3
+
NH
3
+ CH COO-
CH
2
COO-
NH
3
+ CH COO-
CH
2
OH

- tape 3: On lue (on rince) la colonne avec une solution de NaCl un peu
plus concentre.

Les ions Na
+
tant plus nombreux que prcdemment ils vont entrer en
comptition avec les acides amins pour se fixer sur la colonne.
Ils vont remplacer tout dabord les acides amins les moins positifs.
NH
3
+ CH COO-
CH
2
OH
NH
3
+ CH COO-
CH
2
COO-
CH
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
NH
3
+
COO- NH
3
+
Asp
Lys
Ser
Les Protines: Purification

- tape 4: On augmente la concentration en NaCl de lluant.

La concentration en Na
+
tant plus forte, seuls les acides amins les plus
chargs vont rester fixs la colonne.
NH
3
+ CH COO-
CH
2
OH
CH
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
NH
3
+
COO- NH
3
+
Lys
Ser

- tape 5: On augmente encore la concentration en NaCl de lluant.

Les ions Na
+
sont en large excs, ils vont remplacer toutes les molcules
qui taient encore sur la colonne.
CH
CH
2
CH
2
CH
2
CH
2
NH
3
+
COO- NH
3
+
Lys
Les Protines: Purification

On a rinc la colonne avec un gradient de concentration en NaCl
1
2
3
4
1-2: On dpose le mlange, les molcules les plus charges se fixent tout
de suite alors que les moins charges se fixent plus bas.
3-4: On rince la colonne avec une solution de NaCl de concentration
croissante. On dcroche successivement les diffrentes molcules.

Dans lexemple prcdent on a modifi la force ionique de lluant pour
dcrocher les diffrents acides amins.
On aurait galement pu modifier le pH de lluant et garder une
concentration en NaCl constante. En fonction de leur pKa respectifs les
acides amins auraient chang de charge et se seraient dcrochs de la
colonne.

Le principe est strictement le mme pour une protine.
Chromatographie daffinit: On greffe sur la colonne une molcule qui
interagit de faon spcifique avec la protine que lon veut purifier.

1-2: Quand on met le mlange sur la colonne, seule la protine qui peut
interagir avec le ligand se fixe.
3-4: Pour dcrocher la protine de la colonne, on lue avec une solution
contenant le ligand.

2 1
3
4

Chromatographie de permation sur gel (ou dexclusion):
On parle aussi de tamisage molculaire car cette technique spare les
protines en fonction de leur taille.

La colonne est remplie de billes poreuses. Les petites molcules pourront
passer par ces pores et entrer dans les billes alors que les grosses
molcules en seront exclues.

Les petites molcules vont donc perdre du temps dans les billes alors
que les grosses molcules vont trs vite traverser la colonne.

retard
lution avec le
volume mort
(Vm)
grosses
molcules
exclues
petites molcules
incluses
Chromatographie de permation sur gel
billes poreuses
Avec ce type de chromatographie, il ny a pas dinteractions directes
entre la phase stationnaire et les molcules.
ce sont les molcules les plus grosses qui migrent le plus vite.


Dtection des protines:
On utilise les proprits dabsorption de la lumires des acides amins
aromatiques.
Ces acides amins absorbent la lumire 280 nm
On pourra ainsi dtecter la sortie de toutes les protines de la colonne.
dtecteur
280nm
Volume dlution
absorption
Pour savoir o se trouve la protines recherche il faudra doser son activit
REACTION A LA NINHYDRINE.
Detecteur uv .
Enregistreur + Trace.
temps de rtention (min)
DO
215 nm
L'lectrophorse est une technique biochimique
de sparation fonde sur le fait que des
molcules portant des charges lectriques
diffrentes migrent des vitesses diffrentes
lorsqu'elles sont places dans un champ
lectrique.
llectrophorse est devenue une technique de
routine dans les laboratoires o on lutilise pour
sparer notamment les protines et les acides
nucliques.
Llectrophorse des protines peut tre ralise
sur des supports varis, notamment sur gel de
polyacrylamide ou sur gel dagarose
Deux facteurs vont influencer la migration des protines: leur
charge et leur taille. Plus la protine est charge plus sa migration
sera importante. Au contraire plus la protine sera grosse moins
sa migration sera importante.

Le sens de migration de la protine va dpendre de son pI (point
isolectrique). En fonction du pH la protine sera charge
positivement ou ngativement, elle migrera donc vers lanode
(charge +) ou la cathode (charge -).
migration protines charges -
migration protines charges +
dpt
anode +
cathode -
Cuve pour lectrophorse clinique
Prparation du gel et dpt des
chantillons
Les gels supports
prts l'emploi sont
constitus d'une mince
couche d'agarose
coule sur un support
plastique de 100 mm
x 75 mm permettant
leur manipulation
aise.
Une fois le gel sorti de son
emballage, la zone de dpt est
essore avec une bande de papier
filtre pour faciliter la diffusion des
chantillons lors du dpt.
Essorage de la zone de dpt

La bande est ensuite retire et jete et on
dispose la mme place un masque de
dpt form d'une bande de plastique
comportant 10 fentes.
Mise en place du masque de dpt

Dpt des chantillons Essorage du liquide en excs
Un volume de 5 L des chantillons
analyser est dpos sur les fentes et
abandonn pendant 5 minutes pour
assurer leur diffusion au niveau de la
zone de dpt.
Le liquide non absorb par le gel est
ensuite essor avec une autre bande
de papier filtre et le masque de dpt
est jet.
Gel en place dans la cuve
Phase de migration
Le gel est alors mis en place dans la cuve
et puis aprs fermeture du couvercle et
mise en marche de lalimentation, la
migration des protines dmarre
La tension applique au gel et le temps de
migration dpendent de la nature des
chantillons analyser.

Ensemble du dispositif d'lectrophorse
Fixation et coloration
Une fois la migration lectrophortique termine,
le gel est plong pendant deux minutes dans le
fixateur (acide alcool), sch puis plong
pendant trois minutes dans le colorant.
Une succession de bains dans la solution de
dcoloration permet ensuite d'liminer la
coloration du fond de faon faire apparatre les
bandes correspondant aux diverses protines
spares.
Dcoloration du fond
Le gel est ensuite sch ce qui
permet de le conserver dans de
bonnes conditions.

lecture
peut se faire l'oeil nu (analyse qualitative)
ou par densitomtrie (enregistrement de
l'absorbance en fonction de la distance de
migration) ; dans ce cas, l'intgration des
pics permet une analyse quantitative des
fractions.
Trac densitomtrique du
protinogramme d'un srum humain
normal

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