FERMENTACIONES

INDUSTRIALES
M. Sc. Ing. JUAN FRANCISCO ROBLES
RUIZ
DEFINICION
Es un proceso en el que se llevan a
cabo cambios bioqumicos en un
sustrato orgnico, por la accin de los
catalizadores bioqumicos conocidos
como enzimas, que son producidos
por tipos especficos de
microorganismos

OBJETIVOS

Conservacion de alimentos: alcohol,
acido lactico.

Produccin de biomasa: levadura
para panificacin, cultivos lcticos


Produccin de productos
especficos: alcohol, cidos
orgnicos, aminocidos, vitaminas,
antibiticos, etc.

Produccin de enzimas: amilasas,
pectinasas, celulasas, proteinasas.

COMPONENTES DE LA FERMENTACION

FACTORES CONTROLABLES: FACTORES CONTROLABLES:
T, O T, O
2 2
, pH, ADITIVOS , pH, ADITIVOS
ENZIMAS ENZIMAS
EXOCELULARES EXOCELULARES
M.O.
M.O M.O
S
Protenas
Carbohidratos
Grasas
PRODUCTOS DE LA
DEGRADACION
Aminocidos
Monosacridos
Acidos Grasos
PRODUCTOS DE
DESHECHO:
Acidos, Alcoholes
Aldehidos,Esteres
Eteres,Antibiticos
Vitaminas
Enzimas
endocelulares
Permeasas
SUSTRATOS EN FERMENTACIONES
CARBOHIDRATOS: son los ms
comunes. De stos se pueden
obtener por accin microbiana:
alcohol, CO
2
, acidos, aminoacidos,
vitaminas, etc.

PROTEINAS: la accin microbiana
produce: polipptidos, pptidos,
aminocidos.

GRASAS: la accin microbiana
produce la hidrlisis de los
triglicridos para producir cidos
grasos.

OTROS SUSTRATOS: como el
etanol que por accin microbiana se
transforma en cido actico.

MICROORGANISMOS EN FERMENTACIONES
Requerimientos bsicos para que un
microorganismo pueda usarse en
fermentacin:
Debe crecer rpidamente en el sustrato
deseado y debe ser fcilmente cultivado
en grandes cantidades
Debe tener estabilidad fisiolgica bajo
las condiciones de cultivo, produciendo
las enzimas requeridas para efectuar la
transformacin deseada en cantidades
suficientes.
Condiciones de cultivo sencillas y fcil de
conservar.
TIPOS DE MICROORGANISMOS
Bacterias:
-Lcticas: Lactobacillus bulgaricus,
Streptococcus lactis, L.delbruekii
-Acticas: Acetobacter pasteurianus,
A. Xilynum, A. Suboxidans
-Butricas: Clostridium acetobutiricum
-Bacilos: Bacillus coagulans
-Actinomicetos

Levaduras:
Saccharomyces cerevisciae, S.
ellipsoideus, S. uvarum, Pachysolen
tannophilus, Kluyveromyces lactis,
Torula, Candida.

Mohos:
Aspergillus niger, A. Oryzae,
Penicillium. Thichoderma viride

FACTORES A CONROLAR EN LA
FERMENTACION
Temperatura: el microorganismo no puede
regular su T interna por lo que su T es
idntica a la del medio de cultivo donde se
desarrolla. Cada microorganismo tiene una
temperatura ptima para su desarrollo y
metabolismo y en funcin a ello se pueden
clasificar en:

-Psicrfilos: Ts entre 1-4C
-Mesfilos: Ts entre 20-40C
-Termfilos: Ts entre 45 y 60C




pH: el crecimiento de los microorganismos
est influenciado grandemente por la
concentracin de iones H
+
del medio
exterior.

-Bacterias: pH 6-9 (neutro)

-Hongos y levaduras: pH 3-6 (cidos)

FACTORES A CONTROLAR EN LA
FERMENTACION
Oxgeno: para los microorganismos implicados en
fermentaciones el oxgeno puede ser beneficioso o
NO. En funcin a esto, se pueden clasificar en:

-Bacterias:
Anaerobias estrictas: ausencia de O
2
: Clostridios
Anaerobias facultativas: ausencia o presencia de
O
2
: Cocos
Aerobias estrictas: presencia de O
2
: Bacilos



-Levaduras: Aerobias facultativas:
Saccharomyces

-Mohos: Aerobios estrictos: Aspergillus,
Penicillium

Aditivos: Determinados compuestos y a
determinadas concentraciones influyen en el
desarrollo de los microorganismos, como
anhidrido sulfuroso, sales, vitaminas, etc.
Ejemplo: urea, fosfato, sulfato.

OPERACIONES EN EL PROCESO DE FERMENTACION
PREPARACION
DEL MEDIO
ESTERILIZACION
DEL MEDIO
PREPARACION
DEL
INOCULO
FERMENTACION
RECUPERACION
DEL
PRODUCTO
FILTRACION
DEL GAS
I II III
IV
V
VI
I. PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO
Tiene que tenerse en cuenta:
-Producto que se desea obtener
-Exigencias del microorganismo
-Disponibilidad y costo

El medio de cultivo debe incluir:
-Fuente de energa: carbohidratos (azcares;
hidrolizados de almidones y celulosa),
hidrocarburos
-Fuente de nitrgeno: aminocidos, rea, sales
nitrogenadas (fosfato de amonio, sulfato de
amonio, etc.)


-Sales minerales: S, P, Fe, Ca, Na, K, etc.

-Otros nutrientes: dependiendo del
microorganismo, como por ejemplo: vitaminas.

-Agua

-Acidos o lcalis para regular el pH

PREPARACION DEL MEDIO DE CULTIVO
La preparacin del medio de cultivo depende
principalmente de la fuente de carbono a utilizar.

En el caso de utilizar azucares directamente
aprovechables por el microorganismo, se hace una
dilucin del azcar con agua hasta la concentracin
ptima para la fermentacin, luego se adicionan los
otros constituyentes y se regula el pH.

En el caso de los materiales amilceos y celulsicos,
se requiere un pretratamiento para obtener azcares
directamente aprovechables. El pretratamiento
consiste en una hidrlisis qumica o enzimtica.


HIDROLISIS
Materiales amilceos:
-Hidrlisis quimica (cida): es llevada a
cabo con cidos inorgnicos como el
H
2
SO
4
o HCl, a altas temperaturas (140-
200C) y presiones (20-60 lb/pulg
2
).

-Hidrlisis enzimtica: es llevada a cabo
por enzimas, previa gelatinizacin del
almidn. Requiere de acondicionamiento y
de equipos.
Las enzimas pueden ser provenientes de: vegetales
(malta, jora), animales (tialina) y microorganismos
(Aspergillus oryzae, Bacillus coagulans)

Materiales celulsicos:
-Hidrlisis qumica (cida): al igual que en el caso de
amilceos, se utilizan cidos inorgnicos y altas
temperaturas y presiones.

-Hidrlisis enzimtica: es llevada a cabo por enzimas,
previa deslignificacin.

Las enzimas son provenientes de hongos:
Thrichoderma reesei, Thrichoderma viride


III. ESTERILIZACION
Se realiza con el objeto de eliminar microorganismos
patgenos o que puedan competir con el
microorganismo fermentativo. Pueden ser:

Tratamiento trmico:
-Batch o lote: la esterilizacin se lleva a cabo en el
propio fermentador, a 100C por un tiempo de 30 a
60 minutos.
En este caso, la ventaja es que el fermentador y el
medio se esterilizan simultneamente, pero tiene la
desventaja de un mayor tiempo de operacin para el
calentamiento y el enfriamiento, sobre todo si se
trabaja con grandes volmenes.



-Contnuo: se realiza en esterilizadores de
placa a una temperatura de 140C por un
tiempo de 30 segundos.
En este caso, se utiliza un menor tiempo
de proceso y se pueden manejar grandes
cantidades, pero el fermentador debe ser
esterilizado previamente.

ESTERILIZACION

Tratamiento qumico: utilizando una
sustancia qumica que inhiba el desarrollo de
los microorganismos patgenos y
competitivos del microorganismo
fermentativo, pero que no afecta el desarrollo
de ste ltimo.
Por ejemplo la utilizacin del anhidrido
sulfuroso en mostos de uva, para la
fermentacion alcohlica en la elaboracin de
vinos.

Filtracin bateriolgica: utilizando filtros
de celulosa o de cermica que tienen
porosidades que no dejan pasar
microorganismos.
Este tipo de esterilizacin se utiliza para
sustancias termolbiles
que tienen que ser adicionadas en el
medio de cultivo como las
vitaminas.


M.Sc. Ing. Amrico Guevara Prez
PREPARACION DEL INOCULO
IV. FILTRACION DEL GAS
El aire (oxgeno), CO
2
o cualquier otro gas que debe
ser suministrado al fermentador debe ser previamente
esterilizado para eliminar los microorganismos
contaminantes.
Se utilizan filtros de profundidad o filtros de exclusin.
Los filtros de profundidad fueron los primeros en ser
utilizados usando distintas fibras naturales como el
algodn. Este ha sido reemplazado por la fibra de
vidrio en filtros grandes, pero an se utiliza en
matraces. Estos filtros no son absolutos ya que los
espacios entre las fibras son mucho ms grandes que
el microorganismo, pero la profundidad de la cama
filtrante asegura que todos los microorganismos sean
removidos.
Los filtros de exclusin son membranas de celulosa
que tienen poros de 0.2-0.45 m que son adecuadas
para eliminar bacterias.



V. FERMENTACIONES
Es la operacin en la que se van a llevar
los cambios bioqumicos del sustrato por
medio de las enzimas de los
microorganismos para obtener productos
como: biomasa y metabolitos secundarios
(alcoholes, acidos, etc.)
Controles:
-Temperatura
-pH
-Aireacin
-Concentracin de sustrato
-Concentracin de producto
ESQUEMA DE UN FERMENTADOR
METODOS DE FERMENTACION
Fermentacin discontnua: batch
Se considera como un sistema cerrado.
Al tiempo=0, la solucin esterilizada de
nutrientes se inocula con microorganismos y
se permite que se lleve a cabo la
fermentacin en condiciones ptimas de
temperatura.
A lo largo de la fermentacin, no se aade
nada, excepto oxgeno (en forma de aire), si
es requerido, un agente antiespumante y
cidos o bases para regular el pH.

La composicin del medio, la
concentracin de biomasa y la
concentracin de metabolitos cambia en
forma contnua como consecuencia del
metabolismo de las clulas y se observa
la curva tpica de crecimiento.
El cese del crecimiento microbiano es
consecuencia del agotamiento del
nutriente esencial o la acumulacin de
productos txicos para la clula.

METODOS DE FERMENTACION
Fermentacin contnua:
Se considera un sistema abierto.
La solucin nutritiva estril se aade continuamente al
biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de
los nutrientes con el producto y los microorganismos se saca
simultneamente del sistema.
La poblacin microbiana se mantiene en estado contnuo de
crecimiento balanceado, al eliminar, de manera contnua algo
del cultivo y reemplazarlo con medio nuevo a la misma
velocidad.


METODOS DE FERMENTACION
Inmovilizacin celular:
La inmovilizacin celular es una tcnica que encierra
una enzima o clula, catalticamente activa, dentro de
un sistema o reactor y evita su salida hacia la fase
mvil que lleva el sustrato y el producto.



METODOS DE INMOVILIZACION CELULAR

a)Entrecruzamiento
Algunos microorganismos tienden a formar
agregados o flculos en cultivos en
suspensin, por ejm. ciertas cepas de
levadura. Las condiciones del medio, como
la adicin de polielectrolitos pueden
producir agregacin.


b)Atrapamiento
Consisten en la oclusin de las clulas dentro
de una estructura que las retiene, sin dejar que
se escapen, pero que deja penetrar los
sustratos y salir los productos. Los
microorganismos pueden ser atrapados en las
siguientes estructuras:
-Geles: poliacrilamida, alginato de calcio
-Fibras: triacetato de celulosa
-Precipitados de hidrxidos metlicos: sales de
cloruro de titanio o zirconio
-Membranas semipermeables de ultrafiltracin o
de pelculas con poros calibrados.


c)Enlace covalente
Consiste En el enlace directo de las
clulas a un soporte activado. El enlace
suele ser con algn componente reactivo
de la superficie celular, por ejemplo
grupos amino, carboxilo, tilo, hidroxilo,
imidazol o fenol de las protenas.
Se utilizan dos tipos de soporte: Orgnico
(celulosa) e Inorgnico (vidrio)

d)Adsorcin
Los microorganismos llegan a la superficie del
soporte, bien por fuerzas dinmicas del fluido,
por sedimentacin o por difusin browniana.
Una vez en la superficie, se adhieren, primero
de una forma reversible por fuerza de Van der
Waals, electrostticas o covalentes y luego
irreversiblemente por secrecin de polisacridos
extracelulares que unen a los microorganismos
entre s y al soporte inerte, formndose el
denominado biofilm.
Se utilizan como soportes: arena, almina,
arcillas, plstico, resinas de intercambio inico.

RECUPERACION DEL PRODUCTO
OBJETIVOS DE LAS OPERACIONES DE
RECUPERACION:
-Concentrar
-Purificar

Las operaciones dependen:
-Naturaleza del producto final
-Tipo de microorganismo utilizado
-Concentracin del producto
-Productos colaterales presentes en el medio
de cultivo
-Grado de purificacin deseado

RECUPERACION DEL PRODUCTO
ETAPAS:
A)Separacin de la biomasa y/o compuestos
insolubles.
Operaciones:
-Sedimentacin
-Floculacin
-Flotacin
-Filtracin
-Centrifugacin


RECUPERACION DEL PRODUCTO
B)Concentracin y purificacin del producto
Operaciones:
-Evaporacin
-Destilacin
-Precipitacin qumica
-Extraccin por solventes
-Cristalizacin
-Secado
-Intercambio inico
-Cromatografa
-Osmosis inversa
-Ultrafiltracin
PRODUCCION DE BIOMASA
A)CON FINES INDUSTRIALES :
Produccin de levadura para
panificacin

a)Sustrato: melaza (sacarosa, glucosa)
-Concentracin de azcar: 0.5-1.5%
-pH: 4.0-4.5 (se regula con H
2
SO
4
)
-Nutrientes: fosfato de amonio
urea
sulfato de amonio
biotina

b)Microorganismo: Saccharomyces cerevisciae

c)Condiciones del proceso:
-T : 26-30C
-Aireacin

d)Control del proceso: determinacin de la biomasa

e)Recuperacin del producto (levadura):
-Centrifugacin
-Filtracin: filtro prensa: se obtiene la levadura prensada
(80-90% humedad)
-Peletizacin
-Secado por aire caliente: se obtiene la levadura
seca activa (8% de
humedad)
FLUJO DE OPERACIONES PARA LA PRODUCCION DE
LEVADURA DE PAN
PREPARACION DEL
MEDIO DE CULTIVO
ESTERILIZACION
INOCULACION
FERMENTACION
CENTRIFUGACION
LAVADO
FILTRACION-PRENSADO
MEZCLADO
ENVASADO
Saccharomyces cerevisciae
>10
6
ufc/ml
-Melaza
-Acido sulfrico
-Agua
-Fosfato de Amonio
-Urea
-Biotina
-T= 26-30C
-Aireacin
-Concentracin de azcar: 0.5-1.5%
- pH 4.0-4.5
-T = 121C
-Tiempo = 20 min
OBTENCION DE LEVADURA DE PAN
PRODUCCION DE BIOMASA
B)CON FINES ALIMENTARIOS: Produccin
de levadura alimento (CPU)

a)Sustrato: azcares:
melaza de caa (sacarosa)
suero de leche (lactosa)
hidrocarburos (petrleo)
-Concentracin de azcar: 0.5-1.5%
-pH: 4.0-4.5
-Nutrientes: fosfato de amonio, urea

b)Microorganismos: Candida utilis, Torulopsis
utilis, Candida arborea, Torula cremoris,
Candida
tropicalis, Kluyveromyces
Lactis.

c)Condiciones del proceso:
-T : 26-30C
-Aireacin

d)Control del proceso: determinacin de la
biomasa


e)Recuperacin del producto (levadura):
-Centrifugacin
-Tratamiento para degradar la pared celular y
para eliminar cidos nucleicos:
choque trmico, eliminacin de los cidos
nucleicos mediante enzimas
intracelulares, enzimas externas, con sales, etc.
-Secado por rodillo o por atomizacin
(concentrado protico con 5-8% de humedad).

FLUJO DE OPERACIONES PARA LA PRODUCCION DE
LEVADURA ALIMENTO
PREPARACION DEL
MEDIO DE CULTIVO
ESTERILIZACION
INOCULACION
FERMENTACION
CENTRIFUGACION
LAVADO
ELIMINACION DE
ACIDOS NUCLEICOS
CONCENTRADO
SECADO
-Melaza
-Acido sulfrico
-Agua
-Fosfato y sulfato de Amonio
-Urea
-Sales
-Concentracin de azcar: 0.5-1.5%
- pH 4.0-4.5
-T = 140C
-Tiempo = 30 seg
Candida utiliz
>10
6
ufc/ml
-T= 26-30C
-Aireacin
METODOS PARA ELIMINAR O DISMINUIR EL CONTENIDO DE ACIDOS
NUCLEICOS
a)Hidrlisis alcalina de ARN de la clula
empleando NAOH
La hidrlisis del ARN da lugar a los
mononucletidos de la purina y la pirimidina,
que se van a encontrar en el sobrenadante
conjuntamente con la protena y otros
componentes, quedando como precipitado
la pared celular, la cual se separa por
centrifugacin. Con este procedimiento son
extrados 90 a 95% de cidos nucleicos y se
obtiene 70 a 80% de protena.

b)Extraccin de ARN con soluciones de
cloruro de sodio u otros compuestos
qumicos
Se basa en la solubilizacin del cido nucleico
por la sal en una muestra homogenizada. Se
utiliza una solucin de 4% de NaCl, con un
tiempo de extraccin de 1 hora a 40C. Se
separa la pared celular por centrifugacin, luego
se precipita la protena llevando la solucin a pH
4.0 (punto isoelctrico), y luego se separa por
centrifugacin, realizando varios lavados.
c)Degradacin por enzimas endgenas
Consiste en la extraccin de ribonucleasas
(normalmente presentes en la levadura en
condicin inactiva) que hidrolizan el cido
nucleico en nucletidos, los cuales se difunden
a travs de la pared celular debilitada y pueden
ser extrados por centrifugacin, lavado o
dilisis. Es as que a 70C por 1 minuto, se
destruyen los inhibidores de las RNASAS y
proteinasas, liberndolas y, luego al ser
incubadas a 50C, se activan las enzimas que
degradan los cidos nucleicos y en menor grado
a las protenas.


d)Degradacin de ARN por enzimas
endgenas y ClNa
El efecto de la sal sobre la extraccin de
ARN est relacionado con el ingreso de la
sal en la clula, debilitando o destruyendo
la estructura de ribosoma (que contiene el
ARN) y al lisosoma (que contiene a la
enzima RNASA en forma latente y
asociada). La RNASA, adems, es
activada por Cloruro de sodio al 3%.
e)Degradacin de ARN por enzimas
exgenas
Consiste en aadir la ribonucleasa
extrada de fuentes ricas en enzimas
(RNASA pancretica) a las suspensiones
de clulas para hidrolizar el cido nucleico
bajo condiciones especficas.

PRODUCCION DE ALCOHOL
a)Sustrato: azcares o hidrolizados de materiales
amilceos y celulsicos

b)Condiciones del sustrato:
-Concentracin de azcar: 10-18% (S. cerevisciae)
20-26% (S. ellipsoideus)
-Nutrientes: fosfato de amonio, sulfato de amonio
-pH: 4.0 - 4.5 (S. cerevisciae)
3.3 - 3.5 (S. ellipsoideus)


c)Microorganismos usados: S. cerevisciae,
S. ellipsoideus, S. uvarum, Kluyveromyces
lactis, K. fragilis, Pachysolen tannophilus,
Schizosaccharomyces pombe

d)Condiciones del proceso:
-Aireacin: se requiere slo al comienzo, para
promover el crecimiento de la levadura, luego la
fermentacin se lleva a cabo en anaerobiosis.
-T: 20-25C.

e)Recuperacin del producto: alcohol
-Destilacin
-Rectificacin

FLUJO DE OPERACIONES PARA LA OBTENCION
DE ALCOHOL
PREPARACION DEL
MEDIO DE CULTIVO
ESTERILIZACION
INOCULACION
FERMENTACION
DESTILACION
RECTIFICACION
-Melaza
-Acido sulfrico
-Agua
-Fosfato y sulfato de Amonio
-Urea
-Concentracin de azcar: 18-20%
- pH 4.0
Saccharomyces cerevisciae
>10
6
ufc/ml
-T = 121C
-Tiempo = 20 min
-T= 25-28C
-Aireacin al inicio, despus
anaerobiosis
OBTENCION DE ALCOHOL
PRODUCCION DE ACIDO ACETICO
a)Sustrato: alcohol etlico, vino, sidra y
cualquier bebida alcohlica de frutas
o bebidas amilceas

b)Condiciones del sustrato:
-Concentracin de alcohol: 10-13%
-Nutrientes: fosfato de amonio, borra de
levadura
-Acidez actica inicial:
3-3.5% (mtodo lento)
1-1.5% (mtodo de fermentacin sumergida)


c)Microorganismos usados: A. aceti, A.
pasteurianus, A. suboxydans, A. ascendens, A.
xylinum.

d)Condiciones del proceso:
-Aireacin: se requiere pero en cantidades
medidas.
-T: 27-30C.

e)Recuperacin del producto: acido actico
-Destilacin
-Rectificacin

FLUJO DE OPERACIONES PARA OBTENER ACIDO
ACETICO (VINAGRE)
PREPARACION DEL
MEDIO DE CULTIVO
INOCULACION
FERMENTACION
DECANTACION
CLARIFICACION
ESTABILIZACION
ENVASADO
-Mosto alcohlico
-Acido actico
-Fosfato de Amonio

Acetobacter suboxydans
Acetobacter pasteurianus
>10
6
ufc/ml
-Concentracin de alcohol: 10%
-Acidez actica: 1-3%
-T= 30C
-Aireacin moderada
FERMENTADORES
FERMENTADORES
PRODUCCION DE ACIDO CITRICO
a)Sustrato: azcares o hidrolizados de
materiales amilceos y celulsicos

b)Condiciones del sustrato:
-Concentracin de azcar: 14%
-Nutrientes:cantidades medidas de sales
de nitrgeno, potasio, fsforo, azufre y
magnesio
-pH: 2.2 - 3.5


c)Microorganismos usados: Aspergillus
niger, Penicillium luteum, Mucor
piriformis.

d)Condiciones del proceso:
-Aireacin: se requiere, pero en
cantidades medidas
-T: 26-28C.

PRODUCCION DE ACIDO CITRICO
e)Recuperacin del producto: acido ctrico
-Filtracin
-Precipitacin con Oxido de Calcio
-Filtracin o centrifugacin
-Tratamiento con H
2
SO
4

-Filtracin
-Decolorado
-Filtracin

-Concentracin
-Cristalizacin
-Centrifugacin
-Lavado
-Secado
FLUJO DE OPERACIONES PARA OBTENER ACIDO
CITRICO
PREPARACION DEL
MEDIO DE CULTIVO
INOCULACION
FERMENTACION
FILTRACION
PRECIPITACION
-Melaza
-Acido sulfrico
-Agua
-Sales de N, K, P. S, Mg, Fe
Aspergillus niger
>10
6
esporas/ml
-Concentracin de azcar: 14%
-pH: 2.2-3.5
-T= 26-28C
-Aireacin moderada
-Hidrxido de Calcio
FILTRACION
-T = 121C
-Tiempo = 20 min
ESTERILIZACION
FLUJO DE OPERACIONES PARA OBTENER ACIDO
CITRICO
PRECIPITACION
FILTRACION
CONCENTRACION
CRISTALIZACION
CENTRIFUGACION
LAVADO
SECADO
-Acido sulfrico
DECOLORACION
FILTRACION
-Carbn activado
OBTENCION DE ACIDO CITRICO