ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA

EEL / USP

Disciplina: Engenharia Bioqumica II A
Programa de Aperfeioamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro
Prof Arnaldo Mrcio
Etapas de um Processo de Purificao
Etapa do processo Operaes unitrias Princpio


Clarificao



Filtrao convencional Tamanho de partculas
Centrifugao Tamanho e densidade de partculas
Filtrao tangencial (membranas) Tamanho de partculas
Floculao Hidrofobicidade de partculas
Rompimento de clulas
H omegeneizao Cisalhamento
Ultra-som Cisalhamento
Moagem em moinho de bolas Cisalhamento
Rompimento qumico ou enzimtico
Hidrlise, solubilizao ou desidratao de
molculas que compem a parede ou a
membrana celular
Purificao de baixa resoluo
Precipitao Solubilidade
U Itrafiltrao (membranas)
Massa molar e raio hidrodinmico de
molculas
Extrao em sistemas de duas fases lquidas Solubilidade, massa molar
Purificao de alta resoluo
Cromatografia de troca-inica
Tipo e densidade de carga na superfcie da
biomolcula
Cromatografia de afinidade (biolgica ou
qumica)
Stios especficos da superfcie de uma
protena (adsoro)
Cromatografia de imunoafinidade
Stios especficos da superfcie de uma
protena (adsoro antgeno/anticorpo)
Cromatografia de interao hidrofbica
Hidrofobicidade

Cromatografia de excluso molecular Massa molar
Membranas adsortivas
Massa molar e caractersticas para adsoro
ou stios especficos da superfcie de uma
protena
Tratamentos finais
Cristalizao
Solubilidade e caractersticas de equilbrio
lquido-slido
Liofi I izao Caractersticas de equilbrio lquido-slido
Secagem Caractersticas de equilbrio lquido-slido
Rompimento Celular
Suspenso
Celular
Clarificao
Rompimento
Celular
Produtos
Intracelulares
Produtos intracelulares tornam o processo de purificao de biomolculas mais difcil
em comparao com produtos extracelulares devido necessidade do rompimento
Aplicados aps a separao e lavagem das clulas;

Clulas animais (possuem apenas membrana), fcil
rompimento com baixa fora de cisalhamento;

Ex.: Clulas animais: rompidas por simples variao da
presso osmtica do meio, adio de detergentes ou
aplicao de ultra-som de baixa intensidade
Forma mais adequada de
Rompimento?
Tipo de microrganismo
Tamanho da clula;
Tolerncia a tenses de cisalhamento;
Necessidade de controle de temperatura;
Gasto de energia;

Parede Celular
Mtodos de Rompimento Celular
Homogeneizador de alta presso
Moinho de bolas
Ultrassom
Mecnicos
Choque osmtico
Congelamento-descongelamento
Aquecimento
Secagem
No-
mecnicos
lcalis
Solventes
Detergentes
cidos
Qumicos
Lize enzimtica
Enzimticos
Homogeneizador a alta presso
Cavitao
Turbulncia
Cisalhamento
Mecnico - Homogeneizador a
alta presso
Este tipo de rompimento provoca aumento da
temperatura do meio, por isso necessita de sistema de
refrigerao

Presses utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi,
velocidades de alimentao da ordem de 180 a 280 m/s
e concentraes celulares de 450 a 750 g/L (massa
mida).
Mecnico - Homogeneizador a alta presso
O desempenho pode ser afetado por:

Presso de operao;
Velocidade de alimentao;
Temperatura;
Estado fisiolgico do microrganismo;
Condies de cultivo;
Tipo de clula e sua concentrao.

tamanho das clulas (maior => rompimento mais fcil)
presso (maior => maior eficincia)
nmero de passagens (mltiplas etapas aumenta o ren-
dimento)


Existe um modelo matemtico para avaliar o
rompimento, que neste caso de 1
a
ordem em
relao ao nmero de passagens e de potncia
em relao presso de trabalho:
log R
m
= k . N . P
a

(R
m
R)
onde:
R
m
a concentrao mxima de protena
disponvel para ser liberada (g/L)
R a concentrao de proteina liberada (g/L)
k a constante de velocidade que depende de T,
X e do tipo de clula
N o nmero de passagens
P a presso
a constante que depende do tipo de
microrganismo e das condies de crescimento
(varia de 0,86 a 2,9) (tabela)
Mecnico Moinho de Bolas
Consiste na passagem da suspenso celular por uma
cmara de triturao (vertical ou horizontal) provida
de um eixo com discos de agitao e preenchida com
esferas de vidro.

O rompimento ocorre devido fora de cisalhamento
aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular
das clulas.
Mecnico Moinho de Bolas
Mecnico Ultra-som
O rompimento ocorre quando ondas sonoras
(~20kHz), so convertidas em vibraes em um
meio lquido e causam o fenmeno de cavitao.

Escala de laboratrio.
Mecnico - Ultrassom
Rompimentos Mecnicos
Desvantagens:

As elevadas foras de cisalhamento provocadas pelos
rompimentos mecnicos podem destruir organelas
celulares e desnaturar enzimas;

Com o rompimento integral das clulas todo o contedo
intracelular, incluindo cidos nuclicos, organelas e
fragmentos celulares liberado junto com a molcula-alvo,
sendo que o homogeneizado celular pode conter grande
quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.