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Imobilizao de Enzimas

JANAINA DUARTE BAUMER


SIANNAH MARIA MAS DIEGO
Prof. Agenor Furigo Jr.
Setembro/2008

Imobilizao de Enzimas

O principal interesse em imobilizar


uma enzima obter um biocatalisador com
atividade e estabilidade que no sejam
afetadas durante o processo.

Imobilizao de Enzimas
Os processos de bioconverso enzimtica tm sido
bastante utilizados na produo, transformao e
valorizao de matrias-primas.

Reaes
Enzimticas

Desvantagens

Reatores
Batelada

Custos operacionais
Baixa Produtividade
Problemas de Remoo da E
Variao na Qualidade dos Produtos

Imobilizao de Enzimas
Visando a obteno de reaes com:
> uniformidade tecnolgica

viabilidade econmica,

Utilizao de Enzimas na
Forma Imobilizadas

Enzimas Livres x
Imobilizadas
Livres

Instabilidade
Rpida perda da
atividade cataltica
No regenerao

Imobilizadas
Reutilizao
Maior estabilidade
(Faixas mais amplas
de pH e Temp.)
Menor interferncia
de inibidores e/ou
ativadores

Mtodos de Imobilizao
Existem duas principais tcnicas:
Modificao qumica da molcula:
+ Substrato no sofre impedimento estrico pela
matriz
- Pode ocorrer ligao atravs do stio ativo
tornando-se inativa

Ligao fsica da enzima em uma matriz inerte:


+ Maior velocidade de reao e facilidade no
preparo
- Impedimento estrico da molcula de substrato

Mtodos de Imobilizao
Mtodos para Imobilizao de Enzimas

Ligao em Suportes Slidos

Confinamento

Matriz
- Adsoro (carvo ativo)
- Ligao Covalente (celulose, slica)
- Ligao Inica (celulose)

Cpsula

Microcpsula

Mtodos de Imobilizao
1. Imobilizao por incluso (Confinamento):
Retidas na rede tridimensional de um polmero
insolvel na gua;
Aprisionadas no interior de cpsulas ou
microcpsulas delimitadas por uma membrana
semipermevel;
No estabelecida ligao qumica ao suporte e
conserva a sua integridade molecular.
1.1 Incluso em uma matriz;
1.2 Encapsulao;
1.3 Microencapsulao.

Mtodos de Imobilizao
1.1 Incluso em uma matriz;
Em linhas gerais consiste no aprisionamento
das molculas de enzimas entre as malhas de
um polmero geliforme.

Mtodos de Imobilizao
1. 1.1 Incluso em uma matriz;
Simples ligao fsica entre enzima e suporte;
Nesse caso no h risco de desnaturao, pois
no so empregados reagentes qumicos,
As limitaes difusionais so intensas.

Mtodos de Imobilizao
1. 1.1 Incluso em uma matriz;
Matriz

Polmeros sintticos
Silicone, Poliuretano, Nylon,
Polissacardeos
Alginato, Quitosana, Pectina,
Protenas
Colgeno, Gelatina Albumina,

Mtodos de Imobilizao
1.2 Encapsulamento:
A enzima imobilizada no interior de esferas,
cujo envoltrio constitudo por um polmero
geliforme e semipermevel.

E
E

E
E

E
E

Mtodos de Imobilizao
1.2 Encapsulamento:
Enzima em uma
soluo aq.de Na
E

Gotejada

Forma-se uma esfera,


dentro da qual as E
ficam retidas
(membrana = polmero
de alginato de Ca)

Soluo aq.
contendo on
bivalentes (Ca2+)

Quando a gota de
alginato de Na entra
em contato com a sol.
salina
E

Mtodos de Imobilizao
1.3 Microencapsulamento
Consiste na preparao de um sist. emulsionado,
onde a enz. est confinada no interior das micelas.
No se pode encapsular enz. que destruam a
matriz polimrica.
Enz. hidrolticas no so adequadas para o
encapsulamento, pois seu substrato de interesse
geralmente de alto peso molecular.
Polimerizao provoca desativao da enzima

Mtodos de Imobilizao
1.3 Microencapsulamento

Soluo aq.
de enzima

Hexametilenodiamina

Resultante da
polimerizao da
diamina com cl.
de sebacila

Fase orgnica

Cl. de sebacila

Emulsificante

Obtm-se as gotculas da
soluo enzimtica
envolvidas por uma
pelcula semi-permevel

Mtodos de Imobilizao
1.3 Microencapsulamento

Mtodos de Imobilizao
Vantagens e incovenientes dos mtodos de
incluso:
Convm a quase todos os tipos de enzimas;
Restrio pelos fenmenos de impedimento
estrico e de difuso atravs do gel ou da
membrana.

Mtodos de Imobilizao
2. Fixao das enzimas sobre suporte slido:
A enzima deve ser fixar to solidamente quanto
possvel;
Bentonita: Insolvel em gua, mas uma vez
hidratada intumesce e abre-se como uma espoja
altamente porosa e carregada magnticamente.

2.1 Fixao por adsoro


2.2 Fixao das enzimas por ligaes covalentes

Imobilizao de Enzimas
2.1. Adsoro
Consiste da unio entre a enz. e um suporte
inerte atravs de interaes inicas, adsoro
fsica, ligaes hidrofbicas e foras atrativas
de Van der Waals.
Suportes:

Orgnicos
Inorgnicos

Derivados da DEAEcelulose, Dowex


Celite, bentonita e
alumina

Mtodos de Imobilizao
2.1 Fixao por adsoro
Trata-se de um mtodo simples, de aplicabilidade
generalizada.

Efetua-se por simples mistura da enz. com o


suporte, mas condies de pH e fora inica
adequados, em seguida lava-se a enz. que no
ficou ligada.
Suportes: Carvo ativado, xidos metlicos, vidros,
resinas polimricas.

Mtodos de Imobilizao
2.1 Fixao por adsoro
Diferentes parmetros vo influenciar na
quantidade de enz. fixada e solidaridade das
ligaes:
Do pH do meio dependem o nmero e a
natureza das cargas sustentadas pelo suporte.
Sais em
[ ] aumentam a solubilidade das
enz.
Com da T existe a probabilidade de se
aumentar a criao de ligaes

Mtodos de Imobilizao
2.1 Fixao por adsoro
Vantagens:
Procedimento extremamente simples custos
Ligao ocorre por simples exposio e as
condies so brandas
Os efeitos difusionais so despresveis
Desvantagens:
Enz. so altamente dependentes de pH,
solventes, substrato e Temp.
Podem ser facilmente dessorvidas com a
alterao destes parmetros
* uma das tcnicas mais usadas.

Mtodos de Imobilizao
2.2 Fixao por formao de ligaes covalentes
A enz. ligada ao suporte inerte mediante
ligaes qumicas covalentes, que so,
normalmente,
estabelecidas
entre
os
aminogrupos primrios e o anel fenlico dos
aa constituintes da enz. com os grupos
reativos do suporte (-CHO;-NCS, dentre
outros).

Mtodos de Imobilizao
2.2 Fixao por formao de ligaes covalentes
Em geral, as reaes so feitas em meio
aquoso, Temp. entre 0C e 25C e o pH
prximo neutralidade
A escolha das condies ir depender da
estabilidade da enz. e do suporte frente ao pH de
formao das ligaes covalentes, assim como a
estabilidade das ligaes suporte-enzima frente
ao pH de utilizao do sistema imobilizado.

Mtodos de Imobilizao
2.2 Fixao das enzimas por ligaes covalentes

Vantagens:
Maior eficincia e estabilidade.
No so to suscetveis a pH, fora inica,
solventes e Temp.
Os suportes so escolhidos por suas propriedades
de solubilidade, grupos funcionais, estabilidade
mecnica, rea superficial, intumescimento e
natureza hidroflica ou hidrofbica.
Suportes: inorgnicos, polmeros naturais e
sintticos.

Mtodos de Imobilizao
2.2 Fixao das enzimas por ligaes covalentes
Suportes:
Vidro;
Slica;
Sephadex;
Celulose;
Nylon;
Poliestireno.

Imobilizao de Enzimas
Efeitos causados pela imobilizao
Ao se agregar uma E a um material inerte, por
mais suave que seja o procedimento, razovel
esperar algum tipo de efeito sobre sua atividade
cataltica.

Imobilizao de Enzimas
Efeitos causados pela imobilizao

Imobilizao de Enzimas
Interferncia da imobilizao sobre a atividade
cataltica da E.

Tabela 3. Caractersticas cinticas e parmetros termodinmicos para a


invertase nas formas solvel e insolvel

Imobilizao de Enzimas
Interferncia da imobilizao sobre a atividade
cataltica da E.

Tabela 3. Caractersticas cinticas e parmetros termodinmicos para a


invertase nas formas solvel e insolvel

Imobilizao de Enzimas
Interferncia da imobilizao sobre a atividade
cataltica da E.

Tabela 3. Caractersticas cinticas e parmetros termodinmicos para a


invertase nas formas solvel e insolvel

Imobilizao de Enzimas
Dentre os vrios efeitos que a imobilizao pode
causar salienta-se:
Modificao da estrutura tridimensional
Efeitos estricos e de conformao
Efeitos de Microambiente
Efeitos difusionais
Resistncia difusionais externas
Efeitos difusionais internos

Imobilizao de Enzimas

Efeitos estricos e de conformao


Quando a enz. ligada ao suporte, pode sofrer
alguma mudana na conformao, o que
poder abalar sua eficincia cataltica.
O processo de interao enz. suporte quase
sempre aleatrio, poder suceder que a regio
do sitio ativo se torne menos acessvel ao
substrato (impedimento estrico).

Imobilizao de Enzimas

Efeitos de microambiente
Quando a E ligada a um suporte inerte, ela
vai ficar sujeita a uma circunvizinhana algo
do que quando esta livre. Esse fato poder se
refletir sobre os valores dos parmetros
cinticos.
Os efeitos da circunvizinhana, que dependem
da natureza fsica e qumica do suporte, podem
acarretar uma distribuio desigual do
substrato, produto e cofatores entre a regio
vizinha do sist. imobilizado e o resto da
soluo.

Imobilizao de Enzimas

Efeitos de microambiente
O comportamento cintico de uma enzima
presa a um suporte carregado pode diferir
daquela apresentado pela enzima livre.

Imobilizao de Enzimas

Efeitos Difusionais
Quando a E imobilizada sobre ou dentro de
um suporte slido, o substrato deve se difundir
do seio da soluo at o sitio ativo da E.
Se a velocidade de difuso do substrato <
que a veloc. de transformao pela E = a veloc.
observada mais baixa do que a esperada,
visto que nem todas as molculas de E estaro
em contato com o substrato, (atingem a
saturao).

Imobilizao de Enzimas

Efeitos Difusionais
Resistncia difusionais externas
Surgem devido ao fato de que o substrato
deve ser transportado do seio da soluo at
a superfcie de catlise
Efeitos difusionais internos
Surgem devido movimentao do substrato
no interior do meio cataltico poroso

Propriedades de Enzimas
Imobilizadas
Medida da atividade:
Atividade residual de E imobilizada mais fraca
que a das E nativa, mas a estabilidade maior
Influencia das condies operacionais:
pH e T desnaturao parcial ou total da
protena;
Imobilizada resistem melhor a variaes de
pH e tratamentos trmicos;

Imobilizao de Enzimas
Vantagens
As enzimas podem ser reutilizadas
Os
processos
qumicos
podem
ser
continuamente
operados
e
prontamente
controlados
Os produtos podem ser facilmente separados
Os problemas de efluentes so minimizados
A repetibilidade do processo pode ser
aumentada
estabilidade
custos

Imobilizao de Enzimas
Desvantagens
Aleatoridade da interao enzima-substrato;
Inexistncia de um mtodo geral
imobilizacao;
Atividade cataltica devido a efeitos:

de

Microambiente

Difusionais
Estricos /
Conformacionais

Imobilizao de Enzimas
Tipos de Suporte
Existem inmeros materiais inertes que podem
ser usados.
A natureza fsica desses suportes pode variar,
desde materiais geliformes at superfcies
slidas (prolas de vidros) recobertas com
alguma substncia capaz de interagir com a E.
A escolha do mtodo de imobilizao e do tipo
de suporte depender, essencialmente, de dois
fatores:
- das caractersticas peculiares da E
- das condies de uso da E imobilizada

Imobilizao de Enzimas
Tipos de Suporte
No existe um mtodo geral de imobilizao e
nem um suporte universal. Geralmente as
condies de imobilizao para uma E s
poderam ser estabelecidas empiricamente.
Enzima

Imobilizar

Escolher o suporte e o
mtodo que apresentam
> atividade

Vrios Suportes e
Diferentes Mtodos
Avaliar a Atividade
do Sistema

Imobilizao de Enzimas
Tipos de Suporte
Tabela 1. Classificao de suportes inertes.

Imobilizao de Enzimas
Tipos de Suporte
Tabela 2. Atividade da esterase de Bacillus
subtilis imobilizada em vrios suportes e por
diferentes mtodos.

Imobilizao de Enzimas
Tipos de Suporte

Imobilizao de Enzimas

Imobilizao de Enzimas

Imobilizao de Enzimas
Exemplo 1:
AVALIAO DA ATIVIDADE DE LIPASES
IMOBILIZADAS EM GEL DE PECTINA
(Santos et al.,1997).

Foi realizado um estudo sobre a atividade de


diferentes lipases (lipases de Candida rugosa,
Pseudomonas cepacia, Mucor javanicus e
Lipolase) imobilizadas em gel de pectina,
avaliando sua atividade cataltica em meio
orgnico.

Imobilizao de Enzimas
A pectina heteropolissacarideo que formar gis
em presena de ctions
Preparo do gel de pectina:

9 mL de uma soluo
tampo fosfato, pH 7,2
Sol. Aq.
de E

esfriada a 40C

0,8 g de pectina ctrica

aquecida at a
completa dissoluo

agitada vigorosa e deixada


esfriar a T ambiente.

Imobilizao de Enzimas
Gel de pectina

Sol. Cl. Clcio

Removidos para um
erlenmeyer contendo
25 mL de hexano.

formar um sist.
rgido e estvel

Cortados em
peq. cubos
de 125 mm3

Foi avaliado a atividade das E imobilizadas neste


gel atravs da reao de esterifcao do c. lurico
com o n-pentanol.
Foram utilizados quantidades equimolares dos
substratos (0,01 mol). As reaes foram realizadas
em uma incubadora sob agitao a 25C.

Imobilizao de Enzimas
Tabela 1 Rendimentos para a reao de
esterificao do c. lurico com o n-pentanol
catalisada por diferentes lipases imobilizadas em
gel de pectina.

Imobilizao de Enzimas
Tabela 1Rendimentos para a reao de
esterificao do cido lurico com o n-pentanol
catalisada por diferentes lipases imobilizadas em
gel de pectina.

Imobilizao de Enzimas
Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e
procedncias (Amano e Sigma), foram imobilizadas
no gel de pectina, nas mesmas condies descritas
anteriormente variando-se a [ ] de enzima.

Imobilizao de Enzimas
Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e
procedncias (Amano e Sigma), foram imobilizadas
no gel de pectina, nas mesmas condies descritas
anteriormente variando-se a [ ] de enzima.

Quanto > a [Enz.] > o rendimento

Imobilizao de Enzimas
Lipases de Candida rugosa com diferentes AE e
procedncias (Amano e Sigma), foram imobilizadas
no gel de pectina, nas mesmas condies descritas
anteriormente variando-se a [ ] de enzima.

Imobilizao de Enzimas
Estes resultados demonstram:
Que quando E so imobilizadas por mtodos de
envolvimento, a quantidade de biocatalisador e
AE so fatores importante para uma catlise +
eficiente, uma vez que as reaes ocorrem por
difuso dos substratos no gel.
Viabilidade do uso do gel de pectina como
suporte para a imobilizao de enzimas e sua
aplicao em meio orgnico.

Imobilizao de Enzimas
Exemplo 2:
Determinao das propriedades catalticas
em meio aquoso e orgnico da lipase de
Candida rugosa imobilizada em celulignina
quimicamente modificada por
carbonildiimidazol
(Fabrcio M. Gomes; Ariela V. de Paula; Grazielle
dos S. Silva; Heizir F. de Castro; 2006)

Imobilizao de Enzimas
Imobilizao da lipase em celulignina
O suporte foi inicialmente neutralizado pela
adio de uma sol. de hidrxido de sdio (0,1 M)
e, em seguida, tratado com carbonildiimidazol
diludo em dimetilsulfxido (5 mg/mL).
A imobilizao consistiu do contato da sol.
enzimtica (250 U) com o suporte previamente
umedecido com hexano na presena de
polietilenoglicol por 21 h.
A enzima imobilizada foi recuperada por filtrao
a vcuo e o sistema lavado com hexano gelado
para reduo do teor de gua.

Imobilizao de Enzimas
Propriedades catalticas da
imobilizada em meio aquoso

lipase

livre

A atividade enzimtica da lipase nas formas livre


e imobilizada foi determinada pelo mtodo de
hidrlise do azeite de oliva.
Para verificar as alteraes causadas nas
propriedades originais da lipase livre, foi
determinada a influncia do pH e da T na AE das
lipases livre e imobilizada, bem como estimados os
parmetros cinticos.

Imobilizao de Enzimas
Influncia do pH

imobilizao deslocou
o pH timo da enz.
livre, para um valor de
pH + bsico.

Imobilizao de Enzimas
Influncia do pH
Mudanas conformacionais
da enz. ou alteraes de [ ]
entre
as
espcies
carregadas,
substrato,
produto, ons H, ons OH,
tanto no microambiente da
enz. imobilizada quanto no
meio
reacional
(macroambiente).

Imobilizao de Enzimas
Influncia da Temperatura

A
imobilizao
parece conferir
alguma proteo
enzima

Imobilizao de Enzimas
Influncia da Temperatura
Imobilizao: Ttima,
o
que
permite
operaes em uma
faixa > de T.
O da Ttima deve-se
ligao da E ao
suporte, impedindo o
desdobramento
da
estrutura terciria.

Imobilizao de Enzimas
Parmetros cinticos
Nas Figuras 3 e 4 so apresentadas as
atividades da lipase livre e imobilizada,
respectivamente, em funo da [ ] de cidos
graxos presentes na emulso leo e gua
contendo diferentes propores de azeite de
oliva (10-50% m/v).

Imobilizao de Enzimas
Parmetros cinticos

Imobilizao de Enzimas
Parmetros cinticos

Sem inibio por P ou


reduo do teor de
gua no meio reacional

Cintica do tipo
Michaelis-Menten

Imobilizao de Enzimas
As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a
Vmax de reao foram calculadas com auxlio do
programa Enzyme Fitter.

Imobilizao de Enzimas
As constantes de afinidade pelo substrato (Km) e a
Vmax de reao foram calculadas com auxlio do
programa Enzyme Fitter.
Mediante imobilizao, a afinidade da lipase pelo
substrato foi . Esse comportamento se deve <
transferncia de massa do meio reacional para o sist.
imobilizado, pois o processo de imobilizao reduz a
difuso do substrato nos interstcios do suporte

Imobilizao de Enzimas
Este um perfil tpico dos sistemas imobilizados,
tendo em vista que a E livre exerce sua atividade
cataltica em um meio homogneo, enquanto a E
imobilizada em um suporte slido deve agir em um
meio heterogneo.
O da atividade das enzimas imobilizadas
s mudanas conformacionais na sua estrutura
terciria
impedimentos estricos.

Imobilizao de Enzimas
Testes de estabilidade
Estabilidade estocagem
A lipase imobilizada foi estocada a uma
temperatura de 4 C por 90 dias.

Imobilizao de Enzimas
Testes de estabilidade
Estabilidade estocagem
A lipase imobilizada foi estocada a uma
temperatura de 4 C por 90 dias.

Estvel por
30 dias

Imobilizao de Enzimas
Estabilidade trmica

Imobilizao de Enzimas
Estabilidade trmica
97%

60%

Imobilizao de Enzimas
Estabilidade trmica

37%
9%

Imobilizao de Enzimas
Exemplo 3:
Imobilizao de Lipase de Candida
antarctica B em Esferas de Quitosana para
Obteno de BiodieseI por
Transesterificao de leo de Mamona
(Cruz Jr., Amrico; Pacheco, Sabrina Moro
Villela; Furigo Jr, Agenor; 2008)

Imobilizao de Enzimas
Produo de biodiesel transesterificao (reao

qumica dos c. graxos contidos nos leos vegetais


ou gorduras animais com o etanol ou o metanol
estimulado por um catalisador - cidos, bsicos ou
enzimticos).
Indstrias qumicas utilizam a catlise bsica.
Esse processo possui vrios inconvenientes
como a baixa seletividade do catalisador, levando
a indesejveis reaes paralelas.
Considerados como not ecologically friendly
Suas desvantagens impulsionaram a pesquisa
por novos catalisadores lipases.

Imobilizao de Enzimas
As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrlise e a
sntese de steres formados a partir do glicerol e c.
graxos de cadeias longas.

Imobilizao de Enzimas
As lipases ( EC 3.1.1.3) catalisam a hidrlise e a
sntese de steres formados a partir do glicerol e c.
graxos de cadeias longas.

Lipase Livre

Invivel

Biopolmero
imobilizadas em suportes
Quitosana
slidos, que lhes
conferem > resistncia e
facilitam sua recuperao

perdem atividade em
condies e meios
desnaturantes

a vida til

Imobilizao de Enzimas
Otimizao do processo de ativao:
O processo de ativao das esferas de
quitosana consistiu em adicionar 2mL de
solues de glutaraldedo 0, 1, 3, 5, 7 e 9% (v/v)
em 30 esferas de quitosana (perodo de
incubao de 24 h 25oC).
Atravs dos resultados obtidos, foi possvel
observar que ocorreu uma significativa queda na
AE do sobrenadante, quando a sol. enzimtica foi
incubada com esferas ativadas com soluo de
glutaraldedo 3%.

Imobilizao de Enzimas
Quando a molcula da E est ligada a um suporte,
ela
precisa
conservar
suas
distncias
intermoleculares o que torna sua conformao +
rgida = + resistente a mudanas conformacionais
induzidas por ag. desnaturantes.
No entanto, quando a [ ] de glutaraldedo usada
muito alta, uma quantia > de grupos aldedos reage
com um nmero > de resduos da E tornando sua
estrutura muito rgida, com conseqente distoro
de sua conformao = a perda de atividade.
Necessidade da otimizao do processo
imobilizao da E nas esferas de quitosana

de

Imobilizao de Enzimas
Caracterizao das E imobilizada comercialmente:
Anlise de AE em pHs (3,0 - 10,0 a 25oC) e
temp. (25 - 100oC em pH 9,0).
Os estudos relacionados ao perfil de atividade x
pH e atividade x temp., revelaram que:
CALB L pH 5,0 e 100C,
NOVOZYM 435 pH 9,0 e 100C

Imobilizao de Enzimas
A reao de transesterificao para a produo do
biodiesel foi realizada atravs da incubao do leo
de mamona e etanol na razo 3:1 juntamente com
3% m/m de E em um reator tipo batelada, de 0,5 L.

Na reao de transesterificao com o leo de


mamona e o etanol, foi possvel observar uma
eficiente taxa de converso de triglicerdeos para
seus respectivos steres etlicos.