CROMATOGRAFA LQUIDA DE

ALTA PERFORMANCE
(HPLC)

TEMA VII: SEPARACIONES ANALTICAS.

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PERFORMANCE.

.
Clasificacin de cromatografa lquida. Trminos
bsicos y definiciones: constante de distribucin,
factor de capacidad, altura equivalente del plato
terico, tiempo muerto, tiempo de retencin,
factor de selectividad, resolucin. Tipos de fases
estacionarias y mviles. Variables para la
optimizacin de la separacin. Cromatografa en
fase normal y reversa. Elucin isocrtica y en
gradiente. Componentes del equipo.
Preparacin de eluyentes y muestras. Anlisis
cualitativo y cuantitativo. Aplicaciones.

1ra clase

CROMATOGRAFA

La cromatografa es una tcnica separativa mediante la cual

dos o ms componentes de una mezcla se separan mutuamente
en funcin de sus afinidades diferentes en dos fases inmiscibles
entre s:
1.- fase estacionaria: slida o
lquida (adherida a un
soporte slido)

2.- fase mvil: gas o lquida

TIPOS DE CROMATOGRAFAS
EN PLACA

EN COLUMNA

slido

slido
FASE
ESTACIONARIA

lquido adsorbido o ligado

sobre un slido

lquido adsorbido
un slido

FASE MVIL

lquido

gas

lquido

ANALITO

lquido

gas
lquido voltil

lquido

CROMATOGRAFA
GASEOSA

CROMATOGRAFA
LQUIDA
4

QU SIGNIFICA HPLC?

HPLC:
FASES ESTACIONARIAS Y EQILIBRIOS DE SEPARACIN
Tamao de partcula extremadamente pequeo:

SLIDO (slica gel, almina, carbn): LSC

equilibrio de adsorcin en sitios
definidos del slido que interactuan
con los grupos funcionales polares del soluto

medio: 5 - 50

..
H-O-Si
..

LQUIDO (unido a soporte slido): LLC

equilibrio de particin entre dos fases lquidas inmiscibles
entre s, estando la fase estacionaria ligada qumicamente
al soporte slido.

polar: fase normal

Fase estacionaria

no polar: fase reversa

SLIDO (gel o slido inorgnico poroso): Cromatografa de exclusin

por tamao o permeacin
En este caso, la fase estacionaria es inerte,
y la separacin se produce por avances y retardos
diferentes en la fase mvil, dentro y fuera de los poros.

SLIDO (resina porosa) con grupos inicos ligados:

equilibrio de intercambio inico
La fase mvil es generalmente una solucin buffer que contiene un
contrain de carga opuesta al del grupo ligado al soporte, en un
estado de equilibrio de cargas. La retencin se debe a la
competencia del soluto con el contrain por el sitio activo.

_
+
+
]

-+
_
+
+
]

LQUIDO (unido a soporte slido como fase reversa): cromatografa de

par inico.
El analito forma un par inico con un contrain en la fase mvil, que puede particionar
con la parte lipoflica de la fase estacionaria, o bien el contrain se carga sobre la fase
estacionaria y acta como intercambiador inico.

Si

Si
O

R1 R2
RCOO- +N
R4
R3

SO3-

+NH

3R

DIFERENTES TIPOS DE HPLC

MICROFOTOGRAFA DE PARTCULAS DE SLICE

DE RELLENO DE COLUMNA

FASES ESTACIONARIAS FIJADAS QUMICAMENTE

10

MECANISMO DE CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN POR TAMAO

Partcula del empaque

Fase mvil

Inyeccin

Tiempo de retencin

poros

La muestra sembrada
contiene molculas
de distinto tamao
Las molculas pequeas
se retienen en los poros
y las grandes salen con
el eluyente

11

ESTRUCTURA DE RESINA DE INTERCAMBIO

INICO DE POLIESTIRENO ENTRECRUZADO
o bien:
-COO- H+
-NH3+ OH-N(CH3)3+ OH-

12

ELUCIN EN COLUMNA

13

El flujo de fase mvil, en trminos de parmetros de la columna,

puede escribirse como:

PARMETROS DE UN CROMATOGRAMA

Inyeccin de muestra

Ancho de pico a mitad de altura =

ancho medio de pico = W/2

El ancho de pico
est dado por la
distancia entre
las intersecciones
de las tangentes
con la lnea base: W

Factor de simetra del pico = A / B

La altura del
pico est dada
por la distancia
entre la lnea
base (a W/2) y la
interseccin con
el pico.

10 % de la
altura

frente del pico a 10% de altura

Frente del
solvente
(sustancia
no retenida)

cola del pico a 10% de altura

Tiempo de retencin de:

Pico de la 1 sust. eluida

Pico de la 2 sust. eluida

15 13

DESVIACIN STANDARD DEL TIEMPO DE RETENCIN

fm
fs

-2(t)

W = 2 * 2(t) = 4*(t)

+2(t)

2da clase

PARMETROS de INTERS CROMATOGRFICO

K

Coeficiente de distribucin K

[ X ]s
[ X ]m

K es constante en un amplio intervalo de concentracin

de soluto. Indica la afinidad del soluto por ambas fases.

Tiempo de retencin total tR1 o tR2 : el tiempo necesario para que una sustancia llegue desde el punto de
inyeccin de muestra hasta el detector.
Tiempo muerto t0 : el tiempo necesario para que una sustancia inerte, no retenida por la columna,
llegue desde el punto de inyeccin hasta el detector. Equivale al frente de solvente.
t R1 t R1 t0

Tiempo de retencin neto:

t R2 t R2 t0

Es el tiempo que el compuesto

permanece retenido por la fase estacionaria.

Factor de capacidad:

k1

t R 1 t0
t0

k 2

t R 2 t0
t0

Es la medida de la posicin del pico de una

sustancia en el cromatograma, caracterstico de la sustancia para esa corrida.

Factor de separacin :

k 2
k1

donde k1 es de una sustancia de referencia. El valor de no

depende de la longitud de la columna, ni de su empaque, ni del espesor de

la fase estacionaria.
Velocidad lineal del eluyente:

L
t0

Es el cociente entre la longitud de la columna y el tiempo

17
muerto; es independiente del dimetro de la columna.

PARMETROS de INTERS CROMATOGRFICO

1: Parmetros de retencin

2: Retencin relativa
La retencin relativa de dos solutos, , donde
1 eluye antes que 2, es:

depende de la naturaleza de la fase

mvil y estacionaria y de la temperatura de
la columna. Siempre se debe tener cuidado
en elegir el mejor par de fases para
separar los solutos ms prximos, los ms
difciles de separar

3: Eficiencia

4: Asimetra

5: Resolucin

Para relacionar las condiciones de la corrida con la

resolucin, o la forma de mejorarla, las ecuaciones deben
plantearse en trminos termodinmicos y cinticos de
sistema.

(21)
42

N1/2 =

1 2 11
(
)
4
2

El coleo puede muchas veces ser atribuido

a una mala combinacin soluto-fs ,
La retencin relativa es igual a k2/k1, resultando la
solucionndose cambiando la columna.
ecuacin fundamental
En CLS o inica, el problema ms comn
La Resolucin queda
es el carcter heterogneo de los sitios de
expresada como producto
retencin debido la no equivalencia entre
de tres factores:
los mismos lo que resulta en sitios de
distinta afinidad. Si estos sitios no estn
1.- la selectividad de la
sobrecargados, la banda eluye con forma
columna, que vara con
normal. Otra posibilidad es eliminar
2.- la velocidad de
selectivamente estos sitios ms fuetes
migracin o factor de
incluyendo un componente desactivante
capacidad (tomado como
en la fase mvil.
CADA FACTOR PUEDE SER
k2 o el valor medio de
Una columna mal empaquetada o una
CALCULADO DIRECTAMENTE
ambos
mala inyeccin pueden producir picos
A PARTIR DEL CROMATOGRAMA
3.- la eficiencia , que
asimtricos.
depende de L/H ( N)

RELACIONES ENTRE LOS PARMETROS

variables de la fase mvil

Factor de capacidad

medida de la afinidad
del soluto con ambas fases

medida de la separacin
entre analitos (proceso
termodinmico)

medida cuantitativa
de la eficiencia (proceso
cintico)

20

FORMAS DE PICOS CROMATOGRFICOS

tiempo
Ideal
ideal

Causa:
Volumen excesivo
de muestra y/o
eluyente demasiado
fuerte.

ancho

Causa:
Concentracin
excesiva del analito:
la capacidad de la
columna
est excedida.

fronteo

coleo

Causa:
Ms de un mecanismo de retencin
del analito.

doble

negativo

Causa:
Canal a la cabecera
de la columna o
presencia de
interferente.

Causa:
Problema
de
deteccin.
21

CAPACIDAD DE CARGA DE UNA COLUMNA

k= K Vs/Vm

k= [X]sVs/[X]mVm

22

RELACIN ENTRE LA ALTURA DE PLATO TERICO

Y LONGITUD DE COLUMNA

23

PARMETROS QUE INFLUYEN EN LA

EFICIENCIA H eff

fm
fs

Transferencia de masa en fs
Transferencia de masa en fm estanca

Aumenta
si:

Transferencia de masa del soluto en fm

Difusin aleatoria
(flujo irregular entre partculas
debido a tortuosidad
y grado de constriccin )

- el camino difusional
(dporo o dpartcula)
la velocidad de difusin
(- viscosidad)
- el espesor de la fs
- k para que pase menos t en fs

El movimiento en fm es complejo debido

al empaquetamiento
Se minimiza con:
a) empaquetamiento compacto
b) canales pequeos
c) solventes poco viscosos

Difusin longitudinal pro y anti sentido

del flujo de fm :
a) importante en LGC
b) apreciable en LLC a bajas u
24

PARMETROS QUE INFLUYEN EN LA EFICIENCIA

ECUACIN DE van DEEMTER
Trmino
Proceso

de la ecuacin
van Deemter

Relacin con las

propiedades del
analito y la columna

: cte; depende de la
Camino mltiple

Difusin
longitudinal

B/u

A = 2dp

B/u = 2gDM/u

fm

Variables
involucradas

fs

calidad del relleno

dp: dimetro de la
partcula
B: coeficiente de difusin
longitudinal
DM: coeficiente de
difusin en la fase
estacionaria
g: factor de obstruccin,
cte; depende de la
calidad del relleno

CS: coeficiente de
Transferencia de
masa en la fase
estacionaria
lquida

CSu

CSu = (fS(k)df2/DS)u

transferencia de masa en
fase estacionaria
fS(k): trmino en
funcin de k para la fase
estacionaria

H = A + B/u + (CS + CM)u

df: espesor de fase

estacionaria
DS: coeficiente de
difusin en la fase
estacionaria

CM: coeficiente de
Transferencia de
masa en la fase
mvil

CMu

CMu = (fM(k)dp2/DM)u

transferencia de masa en
fase mvil
fM(k): trmino en
funcin de k para la fase
mvil
DM: coeficiente de
difusin en la fase mvil

25 20

SEPARACIN DE PICOS CROMATOGRFICOS:

RESOLUCIN
Rs

2(t RB t RA )
>1
WB W A

Rs = N ( 1 ) ( k )

1 + k
eficiencia

capacidad
selectividad

Aumento de , N y k (media entre dos bandas adyacentes)

favorece la resolucin, pero aumenta el tiempo
de corrida; se deben mejorar y k por variacin
del tipo de fase mvil (o eventualmente estacionaria)
26

SEPARACIN DE PICOS CROMATOGRFICOS

t0

Seal

t0

t0

= constante
- W
+ N
+ eficiencia
- H
+ W
- N
+ H

- eficiencia
selectividad

t0

k bajo; se debe disminuir el tamao de partcula, o

aumentar el volumen de fase estacionaria o aumentar
la longitud de la columna, o (selectividad) por
tiempo
(minutos)
variacin
de la composicin de la fase mvil.
27

OPTIMIZACIN DE CROMATOGRAMA

falla

objetivo
Grfico de Van Deemter
Para aumentar la eficiencia
(por disminucin de W
y aumento de N)
se puede aumentar la
longitud de la columna,
disminuir el tamao de las
partculas del empaque y/o
el caudal de la fase mvil y
el volumen muerto extracolumna.

10
5
c
H

28

OPTIMIZACIN DEL CROMATOGRAMA

K

falla

[ X ]s
[ X ]m

k= K Vs/Vm

objetivo

Se debe aumentar el
coeficiente de distribucin
K variando la composicin
del eluyente.
Se mejora la resolucin,
pero tambin significa
aumentar los tiempos de
retencin, de modo que
aumentar el tiempo de la
corrida cromatogrfica.

ptimo: 2 - 10

K pequeos (0 -1) afectan severamente la resolucin.

K>10 no mejora significativamente la resolucin
y aumenta el tiempo del anlisis cromatogrfico.
29

OPTIMIZACIN DEL CROMATOGRAMA

falla

objetivo
Log Nef

Cuando los picos estn

muy juntos ( 1) se debe
modificar el factor de
selectividad cambiando la
composicin de la fase mvil
o la fase estacionaria.
pH y T pueden ser otras
variables de control.

RS=1,5
RS=2,0

30

SITUACIN DE COMPROMISO
CROMATOGRFICO

RESOLUCIN

HPLC

VELOCIDAD

CAPACIDAD

26

31

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
FUERZA DE LOS SOLVENTES

Con un eluyente dbil, el

fenol permanece retenido.

Un eluyente ms fuerte, como

un ter, desplaza al fenol.

1.- Se elije un solvente con polaridad similar al soluto

ms polar
2.- Si kes muy pequeo (eluye muy rpido), se elije
un eluyente menos polar.
3.- Si el tiempo de elucin es muy alto, se elije un
eluyente ms polar.

Un aumento de 0 en 0,05 unidades produce una

variacin de k de 4 5
32

FUERZA DE SOLVENTES EN MEZCLAS BINARIAS

Utilizar una mezcla binaria de solventes puede mejorar la selectividad por variacin de las
fuerzas dipolares o las caractersticas proton-aceptor o protn-donor.
La presencia de un ter en una fase mvil constituda por una mezcla binaria provee
sitios donores para puentes hidrgeno, ya sea con los centros adsorbentes o con las
molculas de un soluto, lo que vara significativamente el factor de separacin.

33

POLARIDAD Y MISCIBILIDAD DE SOLVENTES

34 29

3ra clase
CROMATOGRAFA DE PARTICIN
FUERZA DE LOS SOLVENTES

Cromatografa fase normal

Cromatografa fase reversa

Se utilizan fases mviles de alta polaridad,
(0 altos).

POLARIDAD

Fases estacionarias:
* funciones ciano (polaridad media)
-CH2CH3CN
* fenil silano (interacciones -)
*amino alquil (polaridad alta)
-N(CH3)2

Tipo de
muestra
baja/moderada
polaridad
(soluble en
hidrocarburos
alifticos)
moderada
polaridad
(soluble en metiletil cetona)
alta polaridad
(soluble en
alcoholes livianos)

Relleno de
columna

Fase mvil

C-18
qumicamente ligado

metanol / agua

C-8
qumicamente ligado

acetinitrilo / agua

C-2
qumicamente ligado

1-4 dioxano / agua

Elucin isocrtica: utiliza una nica fase mvil durante toda la corrida,
ya sea un solvente puro o una mezcla de composicin definida:
la fuerza del solvente (0 ) es constante en toda la experiencia.
35

POLARIDAD

Se utilizan solventes de baja polaridad,

RH RH modificados por el agregado de
1 2% de algn solvente ms polar, que
satura los sitios ms activos.

EFECTO DE LA COMPOSICIN DEL ELUYENTE

SOBRE LA EFICIENCIA DE LA SEPARACIN
POLARIDAD

1: 9,10-antraquinona
2: 2-metil-9,10-antraquinona
3: 2-etil-9,10-antraquinona
4:1,4-dimetil-9,10-antraquinona
5: 2-t-butil-9,10-antraquinona

36

CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA

aumenta la longitud de la cadena del siloxano
aumenta la eficiencia de la separacin (por variacin de k)
=5
Eluyente: Metanol / agua = 50/50
Caudal: 1,0 mL/min

37 32

ELUCIONES ISOCRTICA Y CON GRADIENTE

Elucin con gradiente: la fuerza del solvente se vara en el tiempo de la corrida
por variacin de 0 debido a la mezcla en forma continua de hasta tres solventes
en la forma que resulte conveniente, con el objeto de mejorar la resolucin
(variacin de k y ) o los tiempos de corrida cromatogrfica.

38 33

ELUCIN CON GRADIENTE DE COMPOSICIN DE

ELUYENTE

34
39

EQUIPO DE HPLC CON PROGRAMACIN

DE GRADIENTE DE ELUYENTE

35
40

BOMBA RECPROCA

36
41

RULO DE INYECCIN DE MUESTRA

42

VLVULA ROTATIVA DE INYECCIN DE MUESTRA

43

FILTRACIN DE MUESTRA POR MEMBRANA

44

DETECTOR ELECTROANALTICO

45

DETECCIN ABSORCIOMTRICA
CON ARREGLO DE DIODOS

Espectros de absorcin del efluente de la columna tomados a intervalos de 5 segundos, para una mezcla
de tres esteroides; a partir de los datos espectrales, se puede identificar las especies y elegir las condiciones
operacionales para su determinacin cuantitativa.
46

DETECCIN ABSORCIOMTRICA

47

DETECCIN REFRACTOMTRICA

48

CURVA DE CALIBRACIN EN UNA COLUMNA

DE EXCLUSIN POR TAMAO

49

CROMATOGRAFA INICA CON

DETECCIN ABSORCIOMTRICA

50

CROMATOGRAFA INICA: MEMBRANA SUPRESORA

DE CONDUCTIVIDAD

Cromatografa
intercambio catinico

Eluyente

HCl (H+ + Cl-)

Cromatografa de
intercambio aninico

NaHCO3 (Na+ + HCO3-)

H+ +Cl- + Resina+OH- Na+ + HCO3- + Resina-H+

Membrana
Resina+Cl- + H2O
Resina-Na+ + H2O
intercambiadora

51