15/Julio/2014

Anlisis Instrumental:

Electroforesis en Gel de poliacrilamida, en gel de agarosa

y diferencia entre stas dos.
Profesor: Julio Armando Alpuche Prez
Carrera: Ingeniera en Biotecnologa Grupo: 3
Integrantes:
Diana Lizbeth Buenfil Len
Nayla Berenice Muoz Euan
Miguel ngel Dzib Miss
Daniela Prez Yez
Geovanni Edimir Hernndez Garca
Roberto Carlos Ventura Vzquez
Jessica Sharlin Landeros Jurez
Abraham Gustavo Yam Colli
Ricardo Jos Lara Castellanos

Electroforesis en gel de
poliacrilamida.

 Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE,
PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis en ingls)
tcnica ms ampliamente
utilizada para separar
molculas biolgicas
especialmente ADN, ARN
y protenas.

Es un mtodo conveniente,
rpido y econmico a nivel de
muestra, pues se requieren
slo cantidades del orden de
microgramos de protena.

 La poliacrilamida es un

soporte empleado
frecuentemente en
electroforesis en gel, es
qumicamente inerte, de
propiedades uniformes,
capaz de ser preparado
de forma rpida y
reproducible.

Ventajas

Son qumicamente inertes,

transparentes y estables en
un amplio rango de pHs,
temperatura y fuerza inica.
Para el estudio de cidos
nucleicos, el gel de
poliacrilamida se suele
emplear en situaciones donde
se dispone de fragmentos de
bajo tamao molecular (de
menos de 1000 pares de
bases).

En la tecnica de SDS-PAGE,
se mezclan las
protenas con el detergente
aninico SDS para formar
complejos desnaturalizados,
cargados negativamente.

 La electroforesis en geles de acrilamida se puede

realizar empleando sistemas de uno o ms

tampones, en estos casos se habla de sistemas
tampn continuos o discontinuos. En los sistemas
discontinuos el primer tampn asegura la migracin
de todas las protenas en el frente de migracin,
provocndose la acumulacin de todas las que se
han cargado en el pocillo. La separacin realmente
comienza a partir del momento en el que el frente
de migracin alcanza la frontera del segundo
tampn.

Qu es la agarosa?
es un agente fuertemente gelificante, neutral, no
inico considerado como un polmero lineal cuya
unidad bsica es un disacrido.

La agarosa es usada para aplicaciones de

electroforesis conocida como electroforesis en gel
del agarosa.

La electroforesis en gel es un mtodo que se

emplea para separar macromolculas en funcin
del tamao, la carga elctrica y otras propiedades
fsicas.
La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo
normalizado que se utiliza para separar,
identificar y purificar fragmentos de ADN.

 La electroforesis en gel de agarosa es de las ms

utilizadas para analizar y caracterizar cidos nuclecos
de distintas procedencias. Los geles se comportan
como un tamiz molecular y permiten separar
molculas cargadas en funcin de su tamao y forma.
El DNA aislado se puede analizar
mediante electroforesis en gel de agarosa.

Tampn de electroforesis

La movilidad electrofortica del ADN se ve

afectada por la composicin y la fuerza inica
del tampn de electroforesis.
En ausencia de iones, la conductancia elctrica
es mnima y el ADN migra lentamente o ni
siquiera se desplaza.

Concentracin de agarosa

En funcin de la concentracin de agarosa o

tampn, se pueden separar segmentos de
ADN que contengan de 20 a 50 000 pb.
En los geles horizontales, la agarosa se emplea
por lo general en concentraciones
comprendidas entre un 0,7 % y un 3 %.

ADN marcador

Para una tensin, un gel de agarosa y unas

concentraciones de tampn determinadas, la
distancia de migracin depende del peso
molecular del material inicial.
As pues, debe cargarse un ADN marcador de
tamao conocido en las ranuras situadas en
los extremos derecho e izquierdo del gel.

Tampn de carga

Las muestras de ADN que deben cargarse en

el gel de agarosa se mezclan en primer lugar
con un tampn de carga que por lo general
contiene agua, sacarosa y un colorante (por
ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol,
verde de bromocresol, etc.).
La cantidad mxima de ADN que puede
cargarse depende del nmero de fragmentos.

Soporte: (restrictivo) :Poliacrilamida

* Polimerizacin de dos componentes:
Acrilamida + Bisacrilamida
* Variacin de la concentracin variacin del tamao de poro
Electroforesis vertical
Ventajas:
* Gran poder de separacin(resolucin) por CARGA y por
TAMAO.
* Qumicamente inertes.
* Transparentes (densitograma).
* Estables (pH, fuerza inica, temperatura).
* Versatilidad en cuanto al tamao de poro.

Aplicaciones:
Separar protenas
Determinar peso molecular de una protena
Separar protenas oligomricas

SDS-PAGE

Separar protenas en funcin de su pI

Electroenfoque

Separar protenas de mezclas muy complejas

Electroforesis 2D

Ver si hay una protena en concreto

Western Blot

Soporte: (restrictivo)
* Geles de Agarosa molculas grandes (0.1-60 kpb)
* Geles de Poliacrilamida molculas pequeas (6-2000 pb)

Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida)

Separacin por TAMAO

Densidad de carga igual para todas las

molculas por los grupos PO4-

Aplicaciones:

Separar, identificar y purificar fragmentos de

DNA o RNA.
Determinar tamao de un fragmento de DNA.

Geles de agarosa

Separacin de cromosomas enteros

Secuenciacin de DNA.

Geles poliacrilamida

Identificacin de regiones de unin a protenas.

Detectar la presencia de un gen (o secuencia
especfica de DNA) en una muestra.
Determinar si se expresa un gen especfico

Southern Blot

Northern Blot

Soporte: (restrictivo) Agarosa

Electroforesis horizontal

muestra (-)

+
Campo elctrico (DV)

1.
2.
3.
4.

Preparar el gel.
Aplicacin de la muestra.
Electroforesis.
Deteccin por tincin con
Bromuro de Etidio (BrEt): se
intercala en el DNA y al irradiarlo
con luz UV emite fluorescencia.

* Interaccin DNA-DNA (complementacin).

* Detectar en una mezcla una secuencia de DNA especfica (muy
4. Revelado
sensible).
DNA
* Detectar la presencia de un gen, etc.
1. Electroforesis en geles de agarosa

inters

2. Transferencia a membrana
molculas
de DNA

molculas
de DNA

5. Resultado

3. Hibridacin con la sonda radioactiva

Sonda
de DNA

e-

32P

Gel Agarosa

Southern BLOT

Todas los
DNA

DNA
de inters

32P

TAACGT
ATTGCA

DNA
inters

* Interaccin RNA-DNA (hibridacin).

* Detectar en una mezcla una secuencia de RNA especfica (muy sensible)
4. Revelado
* Expresin gnica.
1. Electroforesis en geles de agarosa

RNA
inters

2. Transferencia a membrana
molculas
de RNA

molculas
de RNA
Resultado

3. Hibridacin con la sonda radioactiva

Sonda
de DNA

e-

32P

Gel Agarosa

Northern BLOT

Todas los
DNA

RNA
de inters

32P

TAACGT
AUUGCA

RNA
inters

Marcadores de peso
molecular:

* Mezcla de diferentes
protenas pre-teidas de las que
conocemos el peso molecular.
* Por comparacin y
extrapolacin podemos
averiguar el PM de nuestra
protena.

- El peso molecular del DNA puede ser determinado utilizando la

electroforesis en geles de agarosa.
-Los fragmentos de DNA es necesario correr junto a las muestras
un marcador molecular estndar.
- El marcador molecular estndar posee de 5 a 10 fragmentos de
DNA a los cuales se le conoce el peso molecular.
- Existe una relacin lineal entre el logaritmo del peso molecular
de las molculas y la distancia recorrida en el gel.
-Esta relacin permite crear una curva estndar de la distancia
de migracin versus el log10 del peso molecular de los
fragmento de DNA que se encuentran en el marcador molecular
estndar.
-Esta curva estndar es utilizada para extrapolar el peso
molecular de aquellos fragmentos de DNA en estudio.

Para crear la curva estndar es necesario:

1) Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del
marcador hasta cada una de las bandas observadas en el
marcador. Se repite lo mismo con los fragmentos de DNA en
estudio.
2) Determinar el log10 del peso molecular de los fragmentos
de DNA que se encuentran en el marcador estndar y trazar en
el eje de Y utilizando papel de grfica regular.
3) Trazar la distancia recorrida en el eje de X. Al terminar la
grfica se observa una lnea.
4) Utilizar la distancia recorrida por las muestras y extrapolar
a la lnea para determinar el peso molecular.

Preparacin del gel de agarosa al 1%

1. Pese 0.5 g de agarosa y colquelos en un matraz de 200
ml. Aada 50 ml de amortiguador de la corrida (TBE 1X).
2. Cubra el matraz con un pedazo de papel de aluminio para
evitar la evaporacin del amortiguador.
3. Coloque el matraz en una hornilla y caliente hasta que
toda la agarosa se haya disuelto.
4. Remueva el matraz de la hornilla y djelo enfriar hasta 65
C. Aada 2 l de bromuro de etidio (10 mg/ml).
5. Vierta la agarosa sobre la caja de electroforesis. Permita
que se solidifique.

Sellar molde para la gel con cinta adhesiva

Asegurarse que este bien bien sellada
Disolver 0.8 g de agarosa en 100ml de TBE
Derretir en microondas con incubaciones de
30 segundos hasta que hierva y no se vean
partculas flotando
Dejarla bajar a 55C-60C y servirla en el molde
sellado, colocar peinilla remover burbujas*
* Aadir 1-2l de EtBr (opcional)

Dejar solidificar por 10 15 min, la gel se vera

opaca
Colocar la gel en la camara vaci
Aadir buffer de corrida TBE hasta cubrir los
pozos completamente
Remover la peinilla
Servir las muestras en un orden
predeterminado

Preparacin de la Muestra
6. Coloque 15 l de la muestra de DNA cortado con las
endonucleasas de restriccin en un microtubo de 500 l.
Aada 5 l de amortiguador de la muestra (loading buffer).

7. Coloque 15 l de la muestra del DNA sin cortar con las

endonucleasas de restriccin en un microtubo de 500 l.
Aada 5 l de amortiguador de la muestra.
8. Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a colocar las
muestras en el gel.

9. Coloque el gel de agarosa dentro del tanque de electroforesis.

10. Aada el amortiguador de la corrida (running buffer) al
tanque de electroforesis. Asegrese de cubrir el gel
completamente.
11. Utilizando una pipetta de 1-10 l, aada 5 l del marcador
molecular estndar a la primera fosa del gel.
12. Utilizando una pipetta de 10-100 l, aada los 20 l de la
muestra de DNA cortado con las endonucleasas de restriccin
(preparada en la parte anterior) a la segunda fosa del ge.

13.Coloque los 20 l de la muestra de DNA sin cortar con las

endonucleasas de restriccin (preparada en la parte anterior) a la
tercera fosa del gel.
14.Continu con el paso 4 y 5 para cada grupo de trabajo.

15.Coloque la tapa del tanque de electroforesis y conctela a la caja

de electricidad. Verifique que los polos estn correctamente
conectados.
16.Corra la electroforesis a 80 V por 1 hora.

Conectar el power supply 50-100 V y correr la

gel por 45-75 minutos
Remover la gel y observarla en lampara de luz
UV
Fotografiar y medir distancia en la gel
Preparar grfica de distancia vs log10 del
peso molecular (o bp)

17.Luego de la hora apague la caja de electricidad.

18. Saque el gel de agarosa. Con mucho cuidado colquelo
sobre la lmpara de luz ultravioleta.
19. Utilizando una regla mida las distancias entre las fosas y las
diferentes bandas observadas.