PCR

Reaccin de Polimerasa
en cadena
ALEX BAEZA
ARIEL CARO

Introduccin
PCR creado y desarrollado en los aos 80
Kary Mullis; premio Novel de Qumica en 1993 por su invento.

El PCR es un mtodo utilizado para la amplificacin del DNA in vitro.

Esto se logra usando ciclos repetitivos de;
- Desnaturacion
- Alineamiento
- Extensin
Utilizando un termociclador

La amplificacin del DNA

Repeticin sucesiva (30 50 veces) de un ciclo de tres fases:

Desnaturacion
Alineamiento
Extensin

Cebadores de secuencia conocida y orientacin opuesta

dNTPs
Buffer
Enzima DNA polimerasa termoestable (Thermus aquaticus)

Que necesito para hacer un PCR

-Muestra de DNA
Biopsias

Fluidos corporales
Raspaduras de clulas bucales, cervicales
Pelo, uas

- Buffer:
Tris-HCl (pH 8,3)

- Cationes de Mg+2:
concentraciones de 1,5 mM

- Desoxirribonucleotidos trifosfato (dNTPs):

dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Unidades bsicas para la contruccion del ADN
Concentraciones de 200 mM

- Primer:
17 30 pares de bases
concentraciones entre 0,1 1 mM, y [G-C] 45 55%
No deben ser apareables entre si
Pueden estar marcados con fluoroforos
- ADN polimerasa:
Thermus aquaticus, utilizado para la sntesis del ADN
- DNasa /RNasa
Eliminacion de contaminantes

Eficiencia
Para que el resultado sea reproducible requiere una eficiencia de 100%
Para que sea en un 100%, requiere que el producto se replique por cada ciclo
En la realidad no existe un 100% de eficiencia
Clculo se realiza con la pendiente
de la curva estndar (slope)
E=10(-1/slope)
La eficiencia debe ser aprox 90-100%
Pendiente ideal 3,32

Eficiencia
- Diseo de primer:
primers especficos

- Concentracion de Mg+2:
>[ ] >S <E

- Condiciones de desnaturalizacin:
Hot-Start: Ac anti poli

- Temperatura de hibridacin:
Dada a partir de la Tm (dNTP)

Ajustada (Tm -5C)

- Aditivos:
Buscan mejorar la amplificaion de regiones del DNA con alta [ C G ]
Betaina, sulfoxido de dimetilo, glicerol

Control de contaminacin
- Uso de campana PCR

- Reemplazo de dTTP con dUTP

- Controles
Positivos
Negativo

Blanco de agua

- Termociclador

- Analisis de amplicones de PCR bsico

Electroforesis en gel
- Agarosa 2%
50 2000 pb
- Agarosa 12%
40 400 pb
- RFLP

Hibridacion de transferencia:
Sonda especifica para identificar un amplicon

Southern Blot

- Secuenciacion de productos de PCR

Gold stantard?

- Pirosecuenciacion

Variaciones del mtodo

- PCR multiple
Amplificacion de mas de una secuencia
- Consensus PCR
Amplifica un solo objetivo con secuencias variables o multiples objetivos con secuencias similares
(CAG Hungtingon)

- PCR degenerado
Amplificacion en secuencias variables
Primer degenerado (W A o T), (Y - C o T), (H - A, C o T), (V A, C o G)
- Nested PCR

PCR RT
- Enzima de transcriptasa inversa
Virus de mieloblastosis aviar

Virus de leucemia murina de Moloney

- Union de oligo-dT a la cola Poli-A del mRNA (hibridando)

- Formacion del cDNA

RT-PCR

QPCR
Definicin

Variacin de la tcnica PCR estndar

El objetivo es cuantificar DNA o mRNA en una muestra
Utiliza emisores de fluorescencia para detectar producto
Cuantifica la fluorescencia emitida por cada ciclo

qPCR o PCR cuantitativo en tiempo

real
PCR de punto final da resultados cualitativos,
ya que el resultado que da son amplicones
visualizados a travs de una electroforesis por
un gel de agarosa

QPCR demuestra la cuantificacin de un ADN o

ARN diana, detectando amplificaciones desde
primeras fases del PCR

QPCR
Termociclador especializado
con:
- fuente de luz excitadora
Grabadora de salida
Reacciones de PCR en placas de
microtitulacin

QPCR
Ingredientes son los mismos que un PCR, porque est basado en esta tcnica.
Difiere por la inclusin de emisores de fluorescencia para la deteccin de producto

Fluorocromo no
especfico

Sybr green

Sondas
especficas
(FRET)

Taq man

Deteccin

Fluorocromo no especfico
Sybr green
Se une al surco menor del ADN

Excitado a 298nm emite luz a 522nm

La fluorescencia del sybr green es proporcional a la cantidad de prodcuto

Fret (Resonancia de fluorescencia de

transferencia de energa)
Fluorforo donante puede transferir energa no radiativa a un fluorforo aceptor que est
estrecho de proximidad
R= reportero (reporter)
Q= extintor (quencher)
Taqman es un tipo de sonda FRET
Taq ADN polimerasa posee actividad exonucleasa

Interpretacin de datos
Los datos en bruto de un qPCR son representados
en un grfico que enfrenta fluorescencia v/s nmero
de ciclos
Figura 7 una QPCR prima de datos
I. En este ejemplo, la qPCR basado
en FRET se realiz para detectar el
virus del papiloma humano (VPH)
16 en el control y muestras
clnicas. El ciclo umbral (CT) valor
define un punto muy por encima
de la fluorescencia de fondo y es
un punto de referencia para la
evaluacin de la carga de
amplificacin; el menor nmero
de ciclos adoptadas para alcanzar
este lmite, mayor ser el nmero
de copias en la muestra original.

Curva estndar
En este ejemplo, una curva estndar fue generado a partir de cantidades conocidas de VPH 16
(crculos rojos). Valores de CT (cuadrados azules) de VPH-16 muestras clnicas positivas se
correlacionaron con la curva estndar para evaluar la carga viral.

Eficiencia
Para que el resultado sea reproducible requiere una eficiencia de 100%
Para que sea en un 100%, requiere que el producto se replique por cada ciclo
En la realidad no existe un 100% de eficiencia
Clculo se realiza con la pendiente
de la curva estndar (slope)
E=10(-1/slope)
La eficiencia debe ser aprox 90-100%
Pendiente ideal 3,32

Interpretacin de datos 2: Curva de

disociacin o curva de melting
Ocurre en la denaturalizacin, ah su nombre
La temperatura depende de la longitud del amplicn y las bases de la secuencia
Sirve para analizar si hay diferentes productos de PCR o productos inespecficos
Fluorescencia de mayor intensidad en ADN doble hebra, disminuye al separarse por
denaturacin

Determina la temperatura de melting

(TM)
Tm del producto de PCR: >80C
Tm de dmeros: (entre 70y 80C

Deteccin de SNP mediante curva

melting
Utilizacin de sondas FRET
Sonda especfica donde ocurre el snp (F1)

Control qPCR
Utilizacin de housekeeping o genes de mantenimiento
Su expresin se mantiene relativamente constante en las condiciones
de ensayo
No existe un control endgeno perfecto, depende a eleccin del
investigador

Controles endgenos ms
utlizados
Beta-actina
GAPDH
Beta-2-microglobulina
TATA box bindingprotein(TBP)
Ciclofilina
18S rRNAs
Receptor de transferrina
HPRT
Ribosomalprotein, largePO
Phosphoglyceratekinase2 (PGK2)
Factor de elongacin 1 alpha
-glucuronidasa

Variacin de mtodo
Sistema de mutacin refractario a
amplificacin(ARMS)
Objetivo: detectar SNPs o insercin/delecin

Mediante la hibridacin de cebadores que en su

extremo 3 tienen una base especfica complementaria
Utiliza 3 cebadores:
1) cebador comun (CP) a formas alternativas al alelo
dado
2) (P2) cebador que coincide con una base que define
una forma especfica del alelo
3) (P3) especfico para el extremo 3 alternativo

PCR ARMS
Utilizado para deteccin de mutaciones en Btalasemia, fibrosis qustica y transtornos
mieloproliferativos

Banda control: 463pb

Alelo mutante (V617F): 279 Pb

Alelo normal: 229 pb

Homocigoto: amplific CP/P2 o CP/P3
Heterocigoto: amplific combinacin CP/P2 y CP/P3

JAK2 wild-type allele appears as a melting peak at

61C and the V617F mutant allele appears as a
melting peak at 54C

LA PCR (long and accurate)

PCR larga y precisa
Amplificacin de secuencias de 5 a 20 kb de longitud

PCR estndar solo puede hasta 5 kb (como lmite mximo)

LA PCR utiliza una polimerasa que se combina con polimera de Pfu

Esta combinacin aumenta la capacidad de procesamiento 5-10 veces

Anlisis del estado de metilacin

Hiper o hipometilacin se utilizan como marcadores de cncer u otras condiciones de
enfermedad
Hipermetilacin de un gen se asocia a prdida de su funcin
Tratamiento con bisulfito
Citosinas metiladas no sufren cambio, citosinas no metiladas cambian a uracilo

Durante el PCR el dUTP se sustituye por residuo de tirosina (dTTP)

Anlisis de estado de metilacin

Enfermedades asociadas a disomas uniparental, sea materna
o paterna

Disoma uniparental materna: Sndrome PW

Disoma uniparental paterna : Sndrome de Angelman

Quienes sufren el cambio a uracilo es el alelo paterno

Uso de cebadores paternos y maternos

Deteccin de patgenos infecciosos

Deteccin cualitativa puede ser como diagnstico, ejemplo de Chlamydia trachomatis y
Neisseria gonorrhoeae

Los ensayos cuantitativos pueden ser parte fundamental para respuesta de tratamiento o
aparicin de infeccin resistente como en VIH, VHB, VHC

Mutaciones y deteccin de
microsatlites de expansin de
repeticin
Numerosos transtornos genticos se caracterizan por ser
AD: autosmico dominante
AR: Autosmico recesivo
Ligado al cromosoma x
Autosmico recesivo

Fibrosis qustica
Condiciones judo-asociadas (enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Canavan y anemia de Fanconi)
Hemocromatosis hereditaria
Atrofia muscular espinal

Hemocromatosis
Enfermedad recesiva
Mutacin C282Y o H63D

Heterocigoto: portador
Homocigoto para mutacin :
hemocromatosis

Homocigoto sin mutacin :

normal

Transtornos AD
Acondroplasia y condiciones
asociadas al gen FGFR
Tambin hay asociados a
repeticiones de trinocletidos
(enfermedad de huntington)
>36 repeticiones CAG

Ataxia espino cerebelosa

Cebadores flanquean la regin

donde est contenida la regin con
repeticiones

En caso de Huntington en primer

exn del gen HD

Transtornos ligados al cromosoma X

Repeticin de expansiones anormales asociado al sndrome x frgil
Duplicacin de genes asociado a distrofia muscular de Becker o Duchenne

Tumores familiares
Cnceres asociados con mutaciones hereditarias especficas
APC, BRCA1, BRCA 2, TP53 y RB1

Traslocacin
Sarcomas y leucemias
Uso de RT-PCR para detectar expresin de mRNA proveniente de oncogenes

Sarcomas: rabdomiosarcomas alveolares t(2;13) (q35;q14) PAX3-FKHR oncogen

Sarcoma de Ewing t(11;22) (q24;q12)

Sarcoma sinovial t (x;18) (p11;q11)

Estudio de EMR o enfermedad mnima residual

EMR
La EMR consiste en la persistencia de un clon anormal, an en niveles bajos, durante o tras finalizar el
tratamiento
El inmunofenotipo y/o la citogentica y las tcnicas moleculares pueden ser utilizadas para su estudio
en leucemias y diferentes tumores slidos infantiles. La EMR tiene significado pronstico ya que
puede predecir la recada de la enfermedad y por este motivo, conocer su presencia nos puede
ayudar a plantear estrategias teraputicas para prevenirla
Tcnicas asociadas:

RT-PCR
Citometra de flujo
Inmunocitologa
Fish

Leucemias y linfomas
Leucemia mieloide crnica, t (9;22) (q34;q11), transcripcin de fusin quimrica BCR-ABL

Prueba de identidad molecular forense

Uso de pcr multple

Cebadores flanquean STR

Estudio de paternidad
Exclusin de paternidad
Anlisis de 13 locis

Ms de 2 loci no calzan
Estudio estadsticos para
asignacin paternal

Control de calidad
Contaminacin cruzada por extraccin
de DNA en tejidos parafinados

Provoca degradacin y menor tamao

Limitaciones del PCR

La contaminacin puede influir en la amplificacin dando falsos positivos
Diseo inadecuado del PCR
PCR sin eficiencia probada
No utilizar control de carga o housekeeping
Alternativas al PCR
Reaccin en cadena de la ligasa para detectar Chlamydia trachomatis
Amplificacin mediada por transcripcin (para Mycobacterium )
Amplificacin por desplazamiento de cadena (Legionella pneumophila)
Uso de MLPA (ligacin)