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Espectrofotometria

Fernando Lucas Tibola


201210637
Guilherme de Freitas
201210553
Vincius Rodrigues Rocha 201210612

Espectrofotometria

A espectrofotometria o mtodo de anlises ptico mais


usado nas investigaes biolgicas e fsico-qumicas

espectrofotmetro um instrumento que permite comparar


a radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que
contm uma quantidade desconhecida de soluto, e uma
quantidade conhecida da mesma substncia.

Medidas no espectrofotmetro

Dois
tipos
de
medidas
so
possveis
nos
espectrofotmetros: medida de transmitncia e medida
de refletncia.

necessrio fazer a calibrao do equipamento para


que ele possa fazer as medidas de forma correta

Transmitncia a frao da luz incidente, com


comprimento de onda especfico, que passa por uma
amostra seja nanopartculas em soluo, filmes finos, ps,
entre outras. As medidas de transmitncia podem ser,
facilmente,
realizadas
em
qualquer
tipo
de
espectrofotmetro
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Lei de Beer-Lambert

A lei indica que existe uma dependncia logartmica entre


a transmitncia,T , de luz por meio de uma substncia e o
produto do coeficiente de absoro da substncia, , e a
distncia que a luz viaja atravs do material (ou seja, o
comprimento do caminho), I a intensidade de luz
transmitida e I0 intensidade de luz incidente

Mtodo Espectrofotomtrico
para Determinao de
Vancomicina

Autor: Alvino Rodrigues Junior


Orientador: Prof. Dr. Matthieu Tubino
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Dissertao para obteno de


ttulo de Mestre em Qumica na rea
de Qumica Analtica, apresentada
na
Universidade
Estadual
de
Campinas, 2008.

OBJETIVO

Desenvolvimento de um mtodo analtico quantitativo


para analise de vancomicina na forma de vancomicina
base VCM e na forma cloridrato de vancomicina HVCM
com utilizao de espectrofotometria na regio do visvel.

OBJETIVO

O mtodo tem como princpio a reao da vancomicina


com ons cobre(II), resultando na formao de um
complexo de colorao lils, que apresenta absoro
mxima em 555 nm.

Importncia da determinao da
VANCOMICINA em amostras
Necessidade

da dosagem em fluidos

corpreos.
Manuteno de nveis seguros (<10 mg mL-1);

Ajuste de dose eficaz;

Reduo dos efeitos colaterais;

Controle de qualidade na produo e estocagem.


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VANCOMICINA
Propriedades qumicas

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Propriedades Qumicas:

O frmaco vancomicina, C66H75Cl2N9O24, um antibitico do


grupo dos glicopeptdeos.

Complexa estrutura tricclica (dois anis contendo 16 membros


e o outro 12 membros).

Estes ciclos so conectados por sete ligaes peptdicas.

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Propriedades Qumicas:

Exerce ao contra cocos e bacilos Gram positivos;

Atua como antagonista competitivo da polimerizao da cadeia


de peptideoglicano, formador da parede celular, afetando sua
permeabilidade e inibindo a sntese de RNA (cido ribonuclico)

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PARTE EXPERIMENTAL
Anlises Iniciais:

Anlise Elementar

Espectrofotometria na regio do Infravermelho

Calorimetria diferencial por varredura

Anlise Termogravimtrica
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Anlise Elementar
Anlise da composio de C,H,N da vancomicina de estoque.

Perkin Elmer Elemental Analyzer modelo PE 2400

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Espectrofotometria na Regio
do Infravermelho
10,0 mg VCM (HVCM) + 90,0 mg KBR

Homogeneizado e prensado para formar


uma pastilha

Espectros de infravermelho mdio (entre 400 16


4000 cm-1) da VCM e da HVCM.

Anlise de DSC
Anlise de DSC:

Taxa de aquecimento 10C/minuto;

Temperatura mxima: 250C durante 5 minutos;

Resfriada at 25C com taxa de 10C/minuto;

Resposta: Taxa de Transferncia de Calor X Temperatura.

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Anlise de TGA
Anlise de TGA:
Aumento constante de temperatura;
Temperatura mxima: 800C;
Atmosfera inerte de nitrognio;
Monitoramento da massa da amostra;
Resposta: Massa da amostra X Temperatura

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Mtodo Espectrofotomtrico
Anlise da Vancomicina base (VCM) e
Cloridrato de Vancomicina (HVCM), na
forma pura e em mistura com quatro
excipientes (amido, celulose, lactose, slica),
simulando medicamentos.

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Mtodo Espectrofotomtrico
Reao:

+ +

Complexo de cor lils com mximo de absoro em 555 nm.


Parmetros estudados:
contra-on do sal de cobre(II)
solvente
pH
proporo molar entre solues de vancomicina e do on
cobre(II)
temperatura
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Mtodo Espectrofotomtrico
Construo da Curva Analtica:
Solues estoque de VCM e HVCM, para calibrao
na faixa de 0,001 a 0,01 mol/L, atravs de diluies com
soluo tampo HAc/Ac-, gua-etanol 50 % v/v, pH
3,5.
Gerando 5 solues de VCM e 8 solues de HVCM.
As solues de calibrao foram adicionadas a 1,5
mL de soluo de acetato de cobre(II) 0,06 mol/L. As
anlises de absorbncia foram realizadas em trplicas.
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Mtodo Espectrofotomtrico
Validao do mtodo: comparao com o mtodo da
cromatografia lquida de alta eficincia, como descrito na
British Pharmacopeia, 2002 e USP, 2005. Os dados foram
comparados atravs do teste t pareado de Student.

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RESULTADOS E
DISCUSSO
A hora da verdade!!!

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Anlise Elementar

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Espectrofotometria no
Infravermelho

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Anlise de DSC (VCM)

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Anlise de DSC (HVCM)

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Anlise de TGA (VCM)

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Anlise de TGA (HVCM)

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Desenvolvimento do mtodo

Desenvolvimento da tcnica de quantificao utilizando o mtodo


espectrofotomtrico proposto;

Baseado na reao entre a vancomicina e o on cobre(II), com a formao


de um complexo com colorao lils;

Foram avaliados os seguintes parmetros para otimizao do


procedimento:

1) contra-ons de diferentes sais de cobre(II);

2) solventes para dissoluo do analito e do sal de cobre(II);

3) pH do meio;

4) proporo molar;

5) temperatura.
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1) Estudo da influncia dos contra-ons dos


sais de cobre(II) e dos solventes

Reao de HVCM, dissolvida em gua, com


diferentes solues de sais de cobre(II):
Sulfato,

acetato, nitrato e cloreto,

Dissolvidos

em gua, acetonitrila ou etanol.

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Influncia dos contra-ons


Resultados das reaes com sais:
CLORETO DE COBRE(II)

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Influncia dos contra-ons


Resultados das reaes com sais:
NITRATO DE COBRE(II)

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Influncia dos contra-ons


Resultados das reaes com sais:
SULFATO DE COBRE(II)

35

Influncia dos contra-ons


Resultados das reaes com sais:
ACETATO DE COBRE(II)

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2) Proporo molar

O estudo da proporo foi realizado empregando acetato


de cobre(II) em excesso em relao ao HVCM;

Medidas feitas em 760 nm (max do acetato de cobre(II))

Espectros do complexo formado entre Acetato de Cobre 0,02 mol L-1 em etanol (1,5 mL)
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com HVCM em gua (1,5 mL) em diferentes concentraes.

2) Proporo molar

Os resultados indicaram uma relao molar de 1:1


vancomicina:cobre(II).

Entretanto, optou-se, para o mtodo, na proporo de 1:3


ou mais, visando garantir a complexao total do analito.

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3) Estudo da influncia da temperatura

O complexo precipita em gua. Dificultando a realizao


de medidas espectrofotomtricas.

Para tentar aumentar o intervalo de tempo de


precipitao do complexo, foram feitos alguns estudos do
efeito da temperatura das solues reagentes na
estabilidade da soluo do complexo.

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3) Estudo da influncia da temperatura

Como pode ser observado, o controle de temperatura no


significou aumento de estabilidade do complexo, tenha
este controle sido feito com temperaturas acima ou
abaixo da ambiente.
Optou-se por manter as solues reagentes temperatura
ambiente.

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4) Estudo da influncia do pH

Verificar em qual pH era obtida a maior absorbncia,


portanto maior formao do complexo ao reagir com VCM.

Foi adicionado etanol a essas solues, de modo a obter


solues preparadas sempre em tampo

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4) Estudo da influncia do pH

Estudou-se tambm a adio de etanol, em vrias concentraes, s


solues de VCM e de HVCM, para verificar qual a influncia deste
solvente na reao.

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5) Estabilidade da soluo do complexo

A figura abaixo apresenta os resultados obtidos no monitoramento dos


valores de absorbncia do complexo formado na reao entre:

HVCM e acetato de cobre(II), gua-etanol 50%v/v, pH4,5 durante 20


minutos:

possvel obter medidas de absorbncia com fins quantitativos por pelo menos43
20 minutos.

Condies ideais

Pelos resultados at aqui mostrados considerou-se como


condies ideais para a formao do complexo estvel em
soluo:

O uso de soluo tampo, com pH em 3,5, misturado a um volume


igual de etanol, para a solubilizao da VCM e da HVCM;

Enquanto que para o preparo da soluo de acetato de cobre(II), o


uso de soluo tampo, com pH em 4,5 mostrou-se mais adequando,

Em conjunto com etanol em volumes iguais.

A proporo mnima entre as solues de VCM (HVCM) e acetato de


cobre(II) ficou definida em 1:3 em temperatura ambiente (25 C).

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Figuras de Mrito

Foi avaliado o desempenho do mtodo para a anlise de


VCM e HVCM frente a excipientes comumente usados na
indstria farmacutica.

Para avaliao foram comparados os resultados de


recuperao obtidos pelo mtodo espectrofotomtrico
proposto, com os valores de recuperao obtidos pelo
mtodo de cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC).

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Valores de recuperao de VCM e HVCM, em


porcentagem, na presena de diferentes excipientes,
pelo mtodo proposto e pelo mtodo de referncia.

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Comparao estatstica:
Resultados obtidos para os dois mtodos, usando os desvios
padro admitidos para os dois mtodos com base no critrio
de tolerncia de preciso de 5% para anlise de frmacos.

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Comparaes entre mtodos

Com base nestes resultados, pode-se afirmar que


os dois mtodos so estatisticamente equivalentes
em um nvel de confiana de 0,99 tanto para
HVCM e VCM.

No nvel de 0,95, apenas a lactose misturada


VCM apresenta um valor igual ao limite terico do
teste t.

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CONCLUSO

Concluso sobre os analitos: A partir das anlises


iniciais houve a constatao da presena de gua de
cristalizao em ambos os analitos.

Concluso sobre o mtodo: produziu resultados mais


precisos e mais exatos, tanto em amostras puras quanto
em excipientes, com relao ao mtodo HLPC, que
recomendado. Sendo que um mtodo de execuo
rpida e fcil.

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