TCNICAS DE PURIFICAO E IDENTIFICAO

DE COMPOSTOS ORGNICOS
CROMATOGRAFIA

Efetua a separao, identificao e quantificao de

compostos orgnicos

Separao distribuio dos componentes da

mistura em duas fases, que esto em contato Uma fase
permanece estacionria, outra fase move-se atravs dela
cada um dos componentes da mistura seletivamente
retido pela fase estacionria.

CROMATOGRAFIA
Histrico

M. TSWEET (1903): Separao de misturas de

pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorventes slidos e solventes variados.
ter de
petrleo
mistura de
pigmentos

CaCO
3

pigmentos
separados

CROMATOGRAFIA - Princpio Bsico

Separao de misturas por interao diferencial dos seus componentes entre
uma FASE ESTACIONRIA (lquido ou slido) e uma FASE MVEL (lquido
ou gs).

Classificao:

a)
Considerando a forma fsica do sistema de
cromatografia, define-se a tcnica geral:

Cromatografia planar A fase estacionria disposta

sobre uma superfcie plana.

Cromatografia em coluna - A fase estacionria

colocada em tubo cilndrico.

pigmentos
separados

b)

Considerando o estado fsico da fase mvel:

Cromatografia gasosa onde a fase mvel um gs.

Cromatografia lquida onde a fase mvel um lquido.

Cromatografia em Fluido supercrtico onde a

fase mvel um fluido supercrtico.
c)

Considerando a polaridade relativa das fases:

Cromatografia gasosa a fase mvel um gs inerte e

a separao ocorre devido as interaes das molculas da
amostra com a fase estacionria.

Cromatografia lquida a polaridade de ambas as fases

importante. Chama-se cromatografia lquida com fase
normal quando a fase estacionria mais polar que a fase
mvel e cromatografia com fase reversa quando se tem o
inverso, ou seja, a fase mvel mais polar e a fase
estacionria mais apolar.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA - CCD

- Separao dos componentes de uma mistura atravs
da migrao diferencial sobre uma camada delgada de
adsorvente retido sobre uma superfcie plana.
Adsoro.

Mtodo prtico e rpido

Placa cromatogrfica/Escolha da fase mvel

Separao pela diferena de partio dos componentes

qumicos em duas fases: Fase estacionria (alumina Al2O3
ou SiO2.xH20) e Fase mvel (solvente de eluio)

Cmara cromatogrfica

Semeio da amostra na placa cromatogrfica

Corrida do solvente (Solubilidade/Eluio)

Revelao do cromatograma / Rf

Os adsorventes:
-Slica (SiO2) alto poder adsorvente muito polar.
- Alumina (Al2O3)
-Terra diatomcea Adsorvente neutro. Pouco usada.
Para separaes por partio. Adicionada slica para
diminuir seu poder adsorvente.
- Celulose
-Poliamida maior dificuldade em se aderir ao suporte

CROMATOGRAFIA EM COLUNA
(ADSORO)

pigmentos
separados

- Usa-se uma coluna recheada com um

slido (fase estacionria) e uma fase mvel lquida.

- Adsoro - refere-se a um aumento da concentrao do
material (que est em excesso na fase mvel) entre as
superfcies das fases mvel e estacionria

A Coluna

Escolha do Eluente Em funo da CCD, baixo ponto

de ebulio, srie eluotrpica; Monitoramento - CCD

Enchimento da Coluna

Eluio

Processo de adsoro na coluna:

A atividade cromatogrfica do slido, tendo grupos polares,

aumenta sobre substncias polares;
Ativao dos adsorventes: aquecimento para dessoro da
gua e de outros materiais adsorvidos.
Escolha dos eluentes:

Funes da fase mvel na cromatografia por adsoro:

- Realizar sua funo de solvente, solubilizando os
componentes da amostra;

- - Realizar o desenvolvimento dos componentes da

mistura na coluna;
- - Dessorver os componentes do adsorvente eluio.

CROMATOGRAFIA GASOSA
SEPARAO DE COMPONENTES VAPORIZADOS;
COMBINAO DOS PRINCPIOS DE PARTIO,
ADSORO E VOLATILIDADE;
PRINCPIOS DE SEPARAO:
MESMOS DE OUTROS TIPOS DE CROMATOGRAFIA
_ DIFERENTE NA MECNICA COMO AS SEPARAES
OCORREM.

CROMATOGRAFIA GASOSA
Aplicabilidade

Quais misturas podem ser separadas por CG ?

Para uma substncia qualquer poder ser arrastada por

um fluxo de um gs ela deve ser dissolver - pelo menos
parcialmente - nesse gs.
Misturas cujos constituintes sejam VOLTEIS (=evaporveis)
DE FORMA GERAL:
CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e
que sejam termicamente estveis.

O Cromatgrafo a Gs
1

1 - Reservatrio de Gs e Controles de Vazo / Presso.

2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.
3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrnica de Tratamento (Amplificao) de Sinal.
6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

INSTRUMENTAO Gs de arraste

Fonte de gs de arraste em cilindro de alta presso;

Gases usados: Hlio, nitrognio, hidrognio ou
argnio;
Fatores de escolha: disponibilidade, pureza exigida,
consumo, tipo de detector empregado;
Reguladores de presso/Medidores de vazo
controlam e monitoram o escoamento do gs;
Cromatografia convencional nitrognio;

INSTRUMENTAO - Parmetros de Injeo

TEMPERATURA DO INJETOR - Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas
sem decomposio.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulio do
componente menos voltil
VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado
fsico da amostra
COLUNA

Amostras
Lquidas

Amostras
Gasosas

empacotada
= 3,2 mm (1/4)

0,2 L ... 20 L

0,1 ml ... 50 mL

capilar
= 0,25 mm

0,01 L ... 3 L

0,001 ml ... 0,1 mL

Slidos:
convencionalmente
se dissolve em um
solvente adequado e
injeta-se a soluo

INSTRUMENTAO

Microsseringas para Injeo

LQUIDOS Capacidades tpicas: 1 L, 5 L e 10 L

Microseringa de 10 L:
agulha (inox 316)

mbolo

corpo (pirex)

INSTRUMENTAO - Colunas - Fase estacionria

Colunas Material : slica fundida, vidro pirex, ao inox,
nylon, cobre.
Cromatografia gs slido: Fase estacionria um
slido: polmeros porosos, carvo grafitinizado, slica,
alumina.
Cromatografia gs-liquido: Fase estacionria um
lquido: Lquidos polimricos - polmeros de
polietilenoglicol ou polissiloxano (silicones), no volteis,
-Com recheio colunas empacotadas ( 2 a 4 mm; comp
=0,5 a 10m);
-Sem recheio Filmes polimricos colunas capilares. T
at 450C. ( 0,1 a 0,5 mm; comp = 5 a 100m);
- Suporte inerte Terra diatomcea, Teflon

FE
lquida
SUPORTE
Slido inerte
poroso

Tubo capilar de
material inerte

Para minimizar a perda de FE lquida por

volatilizao, normalmente ela :

Entrecruzada: as
cadeias polimricas
so quimicamente
ligadas entre si

Quimicamente ligadas:
as cadeias polimricas
so presas ao suporte
por ligaes qumicas

INSTRUMENTAO - Temperatura da Coluna

Alm da interao com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSO DE
VAPOR (p0).
Estrutura qumica
do analito
p0 = f
Temperatura
da coluna
Temperatura
da
coluna

Presso
de
vapor

Velocidade
de
migrao

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENO)

INSTRUMENTAO - Colunas: Definies Bsicas

CAPILAR
= 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas
recobertas com um filme
fino (fra-o de m) de FE
lquida ou slida

EMPACOTADA
= 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com slido pulverizado (FE slida ou FE
lquida depositada sobre as partculas do recheio)

INSTRUMENTAO - Temperatura da Coluna

TEMPERATURA DA COLUNA

CONTROLE
CONFIVEL DA
TEMPERATURA
DA COLUNA
ESSENCIAL PARA
OBTER BOA
SEPARAO EM
CG

INSTRUMENTAO
Temperatura

Programao

Linear

Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes)

T
BAIXA: separadas ISOTERMICAMENTE:
COL

- Componentes mais
volteis so separados
- Componentes menos volteis demoram a eluir, saindo
como picos mal definidos

TCOL ALTA:
- Componentes mais volteis no so separados
- Componentes menos volteis eluem mais rapidamente

de

INSTRUMENTAO

Programao Linear de Temperatura

A temperatura do forno pode ser variada
linearmente durante a separao:

Consegue-se boa
separao dos
componentes da
amostra em menor
tempo

FATORES QUE AFETAM A RESOLUO:

Cromatograma ideal: Picos separados e simtricos;
Temperatura da coluna: Programao da temperatura - Evita picos
tardios, melhora a separao;

T P tR
Tamanho da coluna: varia em funo da(s) substncia(s) a ser(em)
analisada(s) Picos assimtricos;
-Colunas empacotadas - Presso do gs de arraste;
-Colunas capilares - facilitam o fluxo;
Fluxo de gs - Velocidade Disperso (independe da interao)
Volume da injeo - Volume Picos largos, picos assimtricos;
Natureza da Fase estacionria sobreposio de picos.
Rudo: linha de base;
Pico detectado Mnimo: h = 2x ou + o rudo.

INSTRUMENTAO - Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eludo,
gerando sinal quando da passagem de substncias que no o
gs de arraste

CROMATOGRAMA

Grfico Sinal x Tempo =

Idealmente: cada
substncia separada
aparece como um PICO
no cromatograma.

INSTRUMENTAO- Detectores
Mais Importantes:
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TRMICA (DCT OU TCD)

Variao da condutividade trmica do gs de arraste.

DETECTOR POR IONIZAO EM CHAMA (DIC OU FID) ons

gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de

H2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELTRONS (DCE OU ECD)

Supresso de corrente causada pela absoro de eltrons

por eluatos altamente eletroflicos.

Cela de Deteco do DCT:

1 Bloco metlico (ao)
2 Entrada de gs de arraste

3 Sada de gs de arraste
4 Filamento metlico (liga WRe) aquecido

4
2

5 Alimentao de corrente
eltrica para aquecimento do
filamento

O efluente da coluna
misturado com H2 e O2
e queimado. Como
numa chama de H2 +
O2 no existem ons,
ela no conduz
corrente eltrica.

Detector por
ionizao de chamas

Quando um composto
orgnico elui, ele tambm
queimado. Como na sua
queima so formados ons,
a chama passa a conduzir
corrente eltrica

DETECTORES
Detector por Captura de Eletrons
PRINCPIO Supresso de um fluxo de eletrons
lentos (termais) causada pela sua absoro por
espcies eletroflicas
Um fluxo contnuo de
eletrons lentos
estabelecido entre um
ando (fonte radioativa
b -emissora) e um catodo.
Na passagem de uma
substncia eletroflica
alguns eletrons so
absorvidos, resultando
uma supresso de
corrente eltrica.

Registradores:
Anlise Qualitativa (Identificao) - A identificao pode ser
feita comparando-se o tempo de reteno de um padro com
o da amostra.
Anlise Quantitativa - Aps obteno do cromatograma, fazse a integrao dos sinais, que tem por finalidade transformar
a intensidade do sinal emitido pelo detector em uma medida
relacionada com a quantidade da substncia analisada na
amostra. A integrao dos sinais pode ser feita usando-se os
seguintes mtodos:

Altura do Pico ou rea do Pico

A = a x wb
2

%A =

rea A

x 100
rea total

ANLISE QUALITATIVA
Tempos de Reteno

tR = f

Interaes analito / FE
Presso de vapor do analito
Condies operacionais (TCOL, FC ...)

Fixas as condies operacionais, o tempo de reteno ajustado de um analito uma constante

AMOSTRA

PADRO

Comparao de
cromatogramas
da amostra e
de uma
soluo padro
do analito
suspeito

ANLISE QUALITATIVA - ESPECTROMETRIA DE MASSAS

1 Molculas da amostra so bombardeadas por eltrons (electron impact =

EI) ou ons (chemical ionization = CI):
ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e-

2 O on formado se fragmenta:
ABCDE.+ AB. + CDE+
ABCDE.+ AB+ + CDE.
ABCDE.+ A+ + BCDE.
3 Os fragmentos inicos formados so separados magneticamente de acordo

ABUNDNCIA

com suas massas moleculares e contados:

ESPECTRO DE MASSAS
do analito

MASSA / CARGA

ANLISE QUALITATIVA - Espectrmetro de Massas

1 Cmara de Ionizao Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os

fragmentos ionizados (carga +1) so repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador
magntico.
2 Sada de Vcuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vcuo (natm).
3 Separador Magntico A ao do campo magntico deixa apenas ons com determinada razo
Massa / Carga atravessar esta rea do equipamento.
4 Detector Uma vlvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo gera um sinal eltrico proporcional
ao nmero de ons que incide sobre o elemento.

ANLISE QUALITATIVA ESPECTROMETRIA DE MASSAS

Fragmentaes da molcula do metanol:

CH3OH + e CH3OH (m/e 32) + 2e
CH3OH CH2OH+ (m/e 31) + H.
CH3OH CH3+ (m/e15) + .OH
CH2OH+ CHO+ (m/e 29) + H2

O Espectro de Massas

m/z = 90

2
0

4
0

6
0

m/Z

8
0

10
0

12
0
- CO

m/Z = 80

m/Z = 118

- (CO + H)

m/Z = 79