Doctorado en Biotecnologa

USACH
Procesos Biolgicos

een Fluorescent Fusion Protein as a Function of Temperature,

Jose L. Toca-Herrera, Seta Kupcu, Valerie Diederichs, Gerald Moncayo, Dietmar Pum, and Uwe B. Sleytr

Bt. Camila Calfio

TM. Gerardo Retamal

Introduction

Green Fluorescent Protein

Reportero de la expresin y localizacin de proteinas en estudio

GFP mutantes

Aequorea victoria
Enhanced GFP

Es producto de una modificacin post-trad.

1.
Auto-cliclodeshidratacin del tripptido
Ser65-Tyr66-Gly67

Autooxidacin del dihidro-anillo resultante

2.

Mayor intensidad de
fluorescencia
GFP es insoluble y no fluorece
en sistemas bacterianos

Detectar marcadores de superficie

Transfecciones retrovirales
Indicador de pH de A. golgi y citosol

Introduction
Como acoplar EGFP a las superficies sin afectar su fluorescencia?
1.
2.

Realizar una proteina de

fisin con Capas-S
Metodologa que permita la
recristalizacin de las
proteinas de fusin en
arreglos cristalinos 2D

SubU.glicoproteicas identicas
Simetria oblicua, tetra, hexagonal
Adoptar su forma
cristalina original

Recristalizarse en liposomas y
polielectrolitos

rSbpA 31-1068/EGFP
Protena de Fusion
N-terminal de EGFP

C-terminal de rSbpA

pH
Comparar las propiedades de rSbpA 31-1068/EGFP con
EGFP y una mezcla equimolar de EGFP y rSbpA

T
Clorhidrato de
guanidina

Results and Discussion

Influence of pH on the Emission Spectra of EGFP, rSbpA311068/EGFP, and the Equimolar Mixture rSbpA + EGFP

rSbpA 31-1068/EGFP
Excitacin a 490nm
rSbpA 31-1068 +EGFP
Fluorescencia emitida a 510 nm
EGFP
Excitacin a 490nm
Fluorescencia emitida a 520 nm

Results and Discussion

5% perdida de Fluorescencia
10% prdida de Flurescencia

La presencia de rSbpA no afecta

significativamente las propiedades
fluorescentes de EGFP

EGFP no interacta con otras

macromolculas manteniendo sus
propiedades fluorescentes

Influence of Temperature on the

Emission Spectra

Altera
el plegamiento
Diminucion
promedio del 50%de las proteinas (EGFP y rSbpA)
de fluorescencia
Colisin
entre molculas aplaca la fluorescencia
(Proceso reversible)

Valores similares para las tres muestras

Results and Discussion

Influence of Guanidine Hydrochloride Concentration on the Fluorescent properties

Disminucion de la Intensidad de
Fluoresencia
35-40% a 2M
70% a 3M
90% a 4M
NF a 6M

La fusin con rSbpA no influencia las propiedades

fluorescentes de EGFP

Conclusions

rSbpA no influye en la emisin de fluorescencia a 510 nm

de EGFP, ya sea en fusin o acompaando en la solucin
Alcanza el mximo de fluoresencia entre pH 7 y 9 a 20C y
en ausencia de clorhidrato de guanidina
No presenta fluorescencia a ph 4 y a 6M de GHCl