TEMA 2

PRODUCCIN INDUSTRIAL DE
ENZIMAS
Procedencia comercial de las enzimas:
microbianas,
de plantas,
de animales

Etapas en la obtencin de enzimas industriales :

seleccin de la fuente
optimizacin de la produccin
extraccin, aislamiento y purificacin
ingeniera y diseo de enzimas

TEMA 2

PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS

ENZIMAS
ANIMALES
PLANTAS
MICROORGANISMOS

CULTIVOS CELULARES

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Los microorganismos son la fuente principal de enzimas de

aplicacin industrial. Presentan numerosas ventajas
Los microorganismos son muy verstiles y tericamente se puede encontrar un
microorganismo que produzca un enzima concreto.
Los microorganismos pueden ser modificados genticamente para producir
mayor cantidad de enzima.
La recuperacin de las enzimas microbianas suele ser fcil, puesto que,
generalmente, son extracelulares.
La produccin de enzimas microbianas requiere materias primas fciles de
conseguir ya que crecen en medios de cultivo con escasos requerimientos.
Los microorganismos son fciles de cultivar, tienen velocidades de crecimiento
y de produccin de enzimas muy alta (baratas, abundantes)
La tecnologa a gran escala para su produccin se encuentra hoy bien
establecida. Fcil escalado
Las enzimas microbianas son ms estables que sus homlogas de plantas y
animales.

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ENZIMAS INTRACELULARES: permanecen en el interior de la clula.

Actan sobre sustratos de bajo peso molecular.
Glucosa isomerasa, glucosa oxidasa, penicilin acilasa, -galactosidasa
pullulanasa y lactasa.
Es necesaria la integridad de la clula para que se sintetice el enzima y
preservar su estabilidad.
Para obtener el producto es necesario romper las clulas y separar el
producto de los restos celulares. Operacin difcil y costosa
Las enzimas aparecen contaminadas con otras protenas intracelulares.

la separacin de las clulas del medio de cultivo permite obtener

preparados muy concentrados que facilitan la purificacin

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ENZIMAS EXTRACELULARES: actan sobre sustratos de alto

peso molecular. Se sintetizan en grandes cantidades. Muy reguladas.

Hidrolasas

Dado que la molcula es segregada fuera de la clula, no se

requieren tcnicas de ruptura celular que a veces son difciles de
aplicar a gran escala.
El nmero de protenas que se segregan es limitado y por eso es
relativamente fcil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla
Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura ms
compacta y menos susceptibles a la desnaturalizacin que las
correspondientes intracelulares.
intracelulares

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ETAPAS EN LA OBTENCIN DE
ENZIMAS INDUSTRIALES

Seleccin de la fuente
Produccin de clulas con un alto nivel de la enzima
Rotura celular y eliminacin de los restos celulares
(enzimas intracelulares)
Concentracin y enriquecimiento
Purificacin con alta resolucin (dependiendo de su uso
final)
Concentracin y formulacin del preparado

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Maximizar la velocidad de sntesis de enzima y su
concentracin para reducir costos.

Experimentacin previa en el laboratorio:

Ciclo celular.
Requerimientos nutricionales.
Constitutiva o inducible.
Intracelular o extracelular.
Mecanismos de control de su sntesis.

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN

Seleccin de una cepa, a partir del medio natural o de colecciones

de cultivo. Factores a considerar:
criterios de seguridad:

daos sobre el producto (propio organismo o por un metabolito)

contaminacin con toxinas
debe crecer en medios simples y baratos
estable en sus propiedades genticas
producir alta cantidad de producto en poco tiempo
fcil de separar

ORGANISMOS TERMFILOS

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN

Mejora de cepas
Incrementar la productividad de la enzima
Reducir o eliminar enzimas contaminantes
Conseguir su sntesis sin necesidad de inductores
Permitir su sntesis en condiciones inadecuadas
1. Mutacin y seleccin
2. Hibridacin
3. Tecnologa de ADN recombinante

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Formulacin y preparacin del medio de cultivo: baratos y fciles de
reproducir. Consideraciones:
Requerimientos nutricionales (C, N, P,S,O, Mg, Ca, etc)
Propiedades de la enzima:
Induccin
Represin por catabolitos
Inhibicin por producto
Mecanismos de liberacin

ESTERILIZACIN
EXTRACCIN DE LA BIOMASA Y RECUPERACIN DE ENZIMA

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OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN
Diseo del equipo y del proceso de fermentacin
FERMENTACIN EN SUSTRATO SLIDO: sustrato insoluble sin fase lquida libre
El proceso est limitado a hongos
Difcil medida de los parmetros del proceso
Difcil control del pH, T, transferencia de oxgeno
La mayora de los sustratos requieren un pretratamiento
Medios de cultivo muy simples
No suele haber contaminacin bacteriana- ESTERILIZACIN
Enzima se recoge muy concentrado
No es necesario mantener inculos
FERMENTACIN SUMERGIDA

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PURIFICACIN
Consideraciones Generales

Necesidad de purificacin
Prdida del enzima:

prdida fsica
inactivacin

pH y temperatura
formacin de espuma
Proteasas
agentes quelantes.

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FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU

AISLAMIENTO Y PURIFICACIN
Factor inactivante

Fuente de enzima

frecuencia

Modo de contrarrestarlo

Calor

cualquiera

universal

Enfriamiento

Frio

cualquiera

raro

Calentamiento

Proteasa

mayora

Comn

Inhibidores de proteasas o
fro

Productos oxidacin
de fenoles

Plantas y hongos

Bastante comn

Agentes reductores

oxidacin

cualquiera

comn

Agentes reductores

Dilucin protena

cualquiera

Bastante comn

Concentracin rpida

Prdida de estabilidad

cualquiera

Bastante comn

Restauracin de ese factor

Inhibidores
especficos

Plantas y bacterias

Raro

Separacin del inhibidor

Metales pesados

cualquiera

Raro

Agentes quelantes

Cambios de fase

cualquiera

comn

Mnima agitacin

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EXTRACCIN, AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

MATERIAL DE PARTIDA

RUPTURA CELULAR

Detergente

Tratamiento con lcali

Tratamiento enzimtico

Tamizacin lquida

Choque osmtico

Agitacin con abrasivos

Tamizacin slida

ELIMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS

SEPARACIN SLIDO-LQUIDO

Centrifugacin

Filtracin
CONCENTRACIN

Precipitacin

Adsorcin

Secado

Liofilizacin

Ultrafiltracin

PURIFICACIN
Cromatografa

Sistemas en dos fases

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EXTRACCIN
CONSIDERACIONES PARTICULARES:
SEGN LA NATURALEZA INTRACELULAR O EXTRACELULAR
necesidad o no de ruptura celular
SEGN LA FUENTE DE ENZIMA:
Microorganismos
Animales
Vegetales

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ELECCIN DEL MTODO DE

RUPTURA
Susceptibilidad de la clula
Caractersticas de estabilidad del enzima
Velocidad del mtodo
Facilidad de separacin de los restos celulares
COSTE del proceso

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MTODOS DE RUPTURA
1. Mtodos qumicos de lisis celular:
1.1 lcali
1.2 lisozima y EDTA
1.3 detergentes: inicos
no inicos

2. Mtodos fsicos de lisis celular:

2.1 sonicacin
2.2 shock por enfriamiento
2.3 choque osmtico
2.4 congelacin y descongelacin
2.5 tamizacin slida
2.6 homogeneizacin con abrasivos
2.7 tamizacin lquida

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EXTRACCIN, AISLAMIENTO Y PURIFICACIN

MATERIAL DE PARTIDA

RUPTRA CELULAR

Detergente

Tratamiento con lcali

Tratamiento enzimtico

Tamizacin lquida

Choque osmtico

Agitacin con abrasivos

Tamizacin slida

ELIMINACIN DE CIDOS NUCLEICOS

SEPARACIN SLIDO-LQUIDO

Centrifugacin

Filtracin
CONCENTRACIN

Precipitacin

Adsorcin

Secado

Liofilizacin

Ultrafiltracin

PURIFICACIN
Cromatografa

Sistemas en dos fases

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CONCENTRACIN Y ENRIQUECIMIENTO
1er paso:
Eliminacin de cidos nucleicos: pH alto, fuerza inica baja, nucleasas
2 paso:
Eliminacin de restos celulares:
Centrifugacin
Filtracin
3er paso:
Concentracin:
Precipitacin
Adsorcin
Ultrafiltracin
Secado
Liofilizacin

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN:
CENTRIFUGACIN
Centrfugas discontinuas
Centrfugas de flujo continuo:
De disco
De rotor tubular
De cestillo

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN:
FILTRACIN
Ultrafiltracin:

Opera a temperatura y presin baja

Suave y no destructiva
No hay inactivacin del enzima
Econmica

Filtracin de flujo tangencial. Fcil escalado

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIN:
CONCENTRACIN
Precipitacin
Sulfato amnico
Solventes orgnicos
Polmeros de alto peso molecular

Adsorcin

polisacridos aninicos
polisacridos catinicos
Cromatografa de afinidad
Otros

Ultrafiltracin
Secado
Evaporacin rotatoria
Secado en spray
liofilizacin

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TCNICAS DE PURIFICACIN:
CROMATOGRAFA
Cromatografa a gran escala:

Se pueden aplicar los mismos mtodos que en cromatografa analtica.

El objetivo principal es purificar grandes cantidades en el menor tiempo
posible (flujos elevados).

Fcilmente escalable (aumento del dimetro de la columna)

Optimizacin previa en el laboratorio.
Saltos de escala progresivos.
Destino final del producto (posible presencia de contaminantes)
Seleccin del tipo de matriz. Eliminacin material particulado, evitar la
adsorcin inespecfica y contaminacin bacteriana.

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TCNICAS DE PURIFICACIN:
Cromatografa
Tipo de matriz

Porosidad

Adsorcin
noespecfica

Rigidez

Estabilidad

Facilidad de
modificacin

Coste
relativo

Dextrano con enlaces entrecruzados

Baja

Baja

Baja

Buena

buena

Bajo/medio

Poliacrilamida
entrecruzados

Baja

Baja

Baja

Buena

buena

Medio

Agarosa

Alta

Baja

Baja

Deficiente

buena

Medio

Agarosa con enlaces entrecruzados

Alta

Baja

Media

Buena

buena

Medio

Compuesto poliacrilamida/dextrano

Alta

Media

Media

Buena

buena

Medio

Compuesto poliacrilamida/agarosa

Media

Baja

Media

Buena

buena

Medio/alto

Polmero acrlico hidroxilado

Media

Media

Media

Buena

buena

Medio

Copolmero etilenglicol-metacrilato

Baja/media

Media

Media

Buena

buena

Medio

Celulosa

Media/alta

Alta

Baja

Buena

buena

Bajo

Slice porosa

Baja/media

Alta

Alta

Deficiente

deficiente

Alto

Polmero orgnico rgido

Media/alta

Baja

Alta

Buena

buena

Alto

con

enlaces

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TCNICAS DE PURIFICACIN
Cromatografa
Intercambio inico
Cromatoenfoque
Afinidad
Interaccin hidrofbica
Filtracin en gel
HPLC

Sistemas acuosos en dos

fases

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TCNICAS DE PURIFICACIN:
Cromatografa
Caracterstica
molecular
aprovechada

Tipo de
cromatografa

Caractersticas

Aplicacin

Tamao

Filtracin en gel

Resolucin
moderada
para
el
fraccionamiento y buena para tampones
intercambiadores.
Capacidad limitada por el volumen de la
muestra

El fraccionamiento es mejor en las

ltimas etapas de la purificacin.
En cualquier momento se pueden
usar tampones intercambiadores y
podr existir una limitacin respecto
al volumen de muestra

Carga

Intercambio inico

La resolucin puede ser alta. Capacidad

alta no limitada por el volumen de la
muestra.
La velocidad puede ser muy elevada
dependiendo de la matriz.

Es ms efectiva en las primeras

fases del fraccionamiento cuando se
van a manipular grandes volmenes.

Cromatoenfoque

La resolucin puede ser alta. La

capacidad puede ser alta. La velocidad
puede ser alta

Es mejor usarla en una purificacin

posterior, ya que las matrices son
caras.

Polaridad

Interaccin
hidrofbica

Resolucin buena
Capacidad muy alta y no limitada por el
volumen de muestra.
Velocidad alta

Puede ser utilizada en cualquier fase,

pero es mejor aplicarla cuando la
fuerza inica es alta tras la
precipitacin con sales o despus de
un inter-cambio inico

Afinidad biolgica

Afinidad

La resolucin puede ser elevada.

Capacidad puede ser alta o baja,
dependiendo del ligando y no limitada por
el volumen de la muestra. Velocidad alta.

Puede emplearse en cualquier etapa,

aunque
normalmente
no
es
recomendable en las primeras fases

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TCNICAS DE PURIFICACIN

Sistemas acuosos en dos fases:

-

Solucin acuosa de dos polmeros

PEG y dextrano

Solucin acuosa de un polmero y una sal

PEG y fosfato potsico

Protenas hidrofbicas
Protenas hidroflicas

fase superior (rica en PEG)

fase inferior

- Aplicaciones:
separacin de restos celulares
enriquecimiento para posteriores pasos de purificacin
concentracin y purificacin de protenas en baja concentracin
- Operacin:
- Mezcla y equilibrado
- separacin

Protein recovery using two-phase systems. Trends in Biotechnology, 3:6 (139-144) 1985

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TCNICAS DE PURIFICACIN
Diseo de enzimas:
La fusin de un gen de inters a secuencias
promotoras eficientes hace que una protena se
sobreexprese.
Dirigir la protena sintetizada de novo al periplasma
de la clula.
Adicin de colas de afinidad.