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FACULT DE MDECINE DE CONSTANTINE

LABORATOIRE DE TOXICOLOGIE CHUC


COURS DE 2E ANNE RSIDANAT
KHAOULA KOULOUGHLI
16 OCTOBRE 2014

Electrophors
e

Plan
I.

Introduction ;

II.

Principe ;

III.

De llectrophorse de zone lEC;

IV.

Electrophorse capillaire ;

V.

Appareillage ;

VI.

Traitement des chantillons

VII. Avantages/inconvnients
VIII.EC

et HPLC ;

IX.

Conclusion ;

X.

Rfrences bibliographiques.

I. Introduction :

Llectrophorseest avec lachromatographie laprincipale des


techniques utilises en biologie pour lasparation et la
caractrisation des molcules.

En toxicologie elle est utilise comme technique complmentaire


des techniques chromatographiques, elle permet la sparation
dun grand nombre de molcules.

Comme la chromatographie, il existe de nombreux modes de


sparations selon la nature des phases mobiles et stationnaires
utilises. Ex: charge dions, partage en phase normale ou
inverse, adsorption, exclusion (1). Capillaire

II. Principe :

Sparer des espces charges sous linfluence dun champs


lectrique :

La sparation seffectue en fonction de :

Charge ;

Poids molculaire ;

Forme ;

pH, force ionique ;

Milieu ;

Temprature ;

Voltage.

Cette diversit de paramtres est une des raisons de la richesse


d'applications de cette technique (3).

III. De llectrophorse de zone


llectrophorse capillaire :

Electrophorse de zone :

Se sont les techniques lectrophortiques classiques, semi-manuelles.

on utilise une bandelette de matire plastique recouverte dune substance


poreuse imprgne dun lectrolyte (gel dagarose, actate de cellulose, etc).

Ses extrmits plongent dans deux rservoirs indpendants contenant


galement cet lectrolyte et relis aux lectrodes dun gnrateur de tension
continue.

Lchantillon est dpos sous forme dun petit trait transversal sur la bandelette,
ventuellement refroidie et emprisonne entre deux plaques isolantes.

Les espces hydrates prsentes migrent en un temps trs variable (sec-H).

La dtection des espces, aprs migration, seffectue gnralement en les


transfrant par un procd par contact sur une membrane, o elles sont rvles
au moyen de sels argentiques ou avec le bleu de Coomassie (protines) ou
dautres ractifs particuliers (bromure dthidium pour lADN) (2).

III. De llectrophorse de zone


llectrophorse capillaire :

Applications:

Electrophorse de protines plasmatiques ;

Electrophorse de lhmoglobine ;

Electrophorse de lADN pour la mee de mutations.

Ex : En toxicologie : test des comtes.

Llectrophorse de zone prsentait certaines limites :

elle dpend du pH vue que la molcule doit tre charge.

Les molcules en solution peuvent aussi sagrger entre


elles formant des entits impossibles dissocier.

VI. Electrophorse capillaire :


Historique

Les premires tentatives de sparation par lectrophorse


capillaire (EC) ont t ralises sur des tubes de 3 mm de
diamtre par Hjerten en 1967.

En 1981, Jorgerson franchit une nouvelle tape, introduisant


l'utilisation de tubes capillaires en silice fondue de 75 um de
diamtre interne, avec dtection par fluorescence directement
travers le tube.

1991, l'quipe de Weinberger et Lurie a t la pionnire de


l'utilisation de lEC en toxicologie analytique en montrant qu'il
tait possible de sparer 18 substances diffrentes.

Thormann et ses collaborateurs (1991) ont ouvert la voie du


dosage de mdicaments et de drogues illicites dans des
chantillons biologiques par EC (3).

VI. Electrophorse capillaire :

En lectrophorse capillaire, le support plan de la technique classique


est remplac par un tube capillaire ouvert ses extrmits, en verre de silice de
trs faible diamtre.

Ce capillaire, dune longueur L variant entre 20 et 80 cm, est rempli dun


lectrolyte tampon.

La solution tampon joue le rle de conducteur qui permet le transport des


espces.

Il est plong dans deux rservoirs contenant la mme solution.

Chaque rservoir est connect une lectrode reli un gnrateur de courant.

La diffrence de potentiel applique peut atteindre 600 V/cm.

Dans ce champs lectrique, toutes espces charge se dplace llectrode


oppose sa charge (1).

Pour limiter lchauffement du capillaire il est prfrable de le placer dans une


enceinte thermostate, sachant galement que la temprature influe sur les
temps de migration (2).

VI. Electrophorse capillaire :


Les

particules en suspension et les molcules


solubles, peuvent porter une charge lectrique
rsultante dont la grandeur et le signe dpendent la
fois de leur taille, de leur nature et de celle de
llectrolyte, en particulier de son pH.

Sous

leffet de divers phnomnes ou actions agissant


simultanment, temprature, viscosit, diffrence de
potentiel, ces particules vont avoir des vitesses de
migration dautant plus grandes quelles seront plus
petites et porteuses de charges plus importantes (2).

VI. Electrophorse capillaire :


Pour

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chaque ion la vitesse limite de migration vEP rsulte

de :
Lquilibre

entre 1). la force lectrique F qui sexerce


dans le champ E sur la particule de charge q.

2).
La

les forces de frottement qui dcoulent de la viscosit


h du milieu.

sparation dpend ainsi du rapport volume/charge de


lion hydrat. Les espces neutres se sparent mal entre
elles, moins dajouter llectrolyte un agent ionique
pouvant sassocier avec elles et provoquer leur
entranement diffrentiel (2).

VI. Electrophorse capillaire :

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Hckel a propos une quation rendant compte de linfluence de ces


facteurs sur la vitesse lectrophortique vEP dun ion assimil une
sphre de rayon r .

Les espces prsentes dans lchantillon sont soumises deux effets


principaux qui se manifestent pour les ions comme pour les molcules
ou les micelles (2).

Les deux effets responsables de la sparation :

1). la migration lectrophortique (mouvement des molcules charges


vers l'lectrode de polarit inverse) 2). flux lectroosmotique (FEO)
(mouvement dlectrolytes li la charge interne du capillaire et du
potentiel appliqu) (3).

1. Mobilit lectrophortique
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lectromigration
:
Tout compos porteur dune charge lectrique se dplace dans
llectrolyte une vitesse vEP qui dpend des conditions de
lexprience et de sa mobilit lectrophortique propre mEP. Ce
paramtre accessible est dfini partir de la vitesse de
migration lectrophortique du compos et du champ
lectrique E :

mEP

= vEP/E = vEP.L/V

. L : longueur totale du
capillaire, V : ddp applique ses extrmits.

On affecte la mobilit lectrophortique un signe (+ ou )


selon la nature cationique ou anionique de lespce ; mEP (cm2
V1 s1) est nulle pour une espce globalement neutre.

On peut obtenir mEP partir dun lectrophorgramme, en


calculant vEP du compos dans un champ E connu en tenant

2. Mobilit lectro-osmotique
lectro-osmose (EOS)
Le

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second facteur qui contrle la migration des


soluts est lcoulement de llectrolyte encore
appel flux lectro-osmotique caractris par sa
mobilit lectro-osmotique, mEOS.

On

dfinit mEOS par la relation :

mEOS

= vEOS/E = vEOSL/V.

2. Mobilit lectro-osmotique lectro-osmose

(EOS)
a plusieurs causes et rsulte de leffet de la paroi interne du capillaire.

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En effet un capillaire de verre de silice nayant pas subi de traitement particulier comporte en
surface de nombreux groupements silanols (SiOH) qui sont ioniss en silanoates (SiO) si le pH
de llectrolyte est suprieur 3. Ces sites anioniques fixes attirent des cations prsents dans la
solution et les ordonnent en deux couches dont lune est colle la paroi et lautre quelque peu
mobile.

Entre ces deux couches nat une diffrence de potentiel (le potentiel Zta ), dont la valeur
dpend de la concentration de llectrolyte et du pH.

Plus au coeur de la solution, le champ lectrique provoque la migration des cations vers la
cathode. Ces ions tant solvats par des molcules deau (flux de cation+H2O) , il apparat un
flux dlectrolyte qui se dirige dans le mme sens. Les anions sont entrans : ils progressent
contre-lectro-osmotiquement .

En revanche si on ajoute un surfactant, tel un ttra alkylammonium, pour inverser la polarit de


la paroi, le flux lectro-osmotique se dirige vers lanode (2).

Ainsi, le FEO entrane vers la cathode d'abord les molcules charges positivement, puis les
molcules neutres, et enfin les molcules charges ngativement (3 ). les cations qui

possdent le

rapport charge/ masse le plus lev migrent avant les cations dont le rapport est plus faible. (3)

Variation du flux lectoendo-osmotique


en fonction du pH :
Plus

le pH augmente => Plus le nombre des


groupements silanols chargs ngativement
augmente.

Si

pH < 4 : flux nul.

Si

4 < pH < 6 : flux augmente.

Si

pH > 6 : flux constant (1).

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En fonction de ce qui prcde, chaque ion a donc une vitesse


apparente de migration vapp qui dpend de la vitesse
lectrophortique et de la vitesse du flux lectro-osmotique :

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vapp = vEP + vEOS.

vapp est aisment calculable partir de llectrophorgramme


partir de , longueur utile du capillaire entre les points dinjection et
de dtection et de tm, son temps de migration.

vapp est donne par la relation :

La mobilit lectrophortique apparente mapp, dfinie par une


relation :

vapp = l/tm.

V. Appareillage :

17

V. Appareillage :

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Capillaire : son choix dpend de lapplication.

Des capillaires en silice fondue non traite sont classiquement utiliss en


toxicologie analytique ;

La longueur d'un capillaire se dfinit par deux paramtres L et 1, qui


sont respectivement la longueur totale et la longueur efficace (longueur
entre l'lectrode d'injection et la cellule de dtection). Le plus
frquemment, 1 varie de 40 60 cm ;

trs ponctuellement : capillaires recouverts de polyacrylamide


permettant une sparation rapide de diffrents barbituriques et
benzodiazepines ou de capillaires recouverts de charges neutres pour la
sparation des formes nantiomriques d'amphtamines (3).

V. Appareillage :
Capillaire

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Haute transmission UV ; Faible fluorescence ;

Diamtre interne = 25-100m ;

Paroi externe : gaine de polyimide (interrompue au niveau du


dtecteur) ;

Extrmits : Immerges dans deux rcipients de 1-5 cm 3 (sol


dlectrolytes) ;

Inclus dans une enceinte rigoureusement thermostate (trs bonne


stabilit thermique) = bonne reproductibilit.

V. Appareillage :
Milieu de migration : solution tampon aqueuse dlectrolytes ou gel
imprgn de cette solution.

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Introduction de lchantillon sur lune des deux extrmits du


capillaire :

Pour introduire un microvolume dchantillon, qui ne doit pas dpasser 1 %


de la longueur utile du capillaire sous peine de voir la rsolution diminuer,
deux procds sont utiliss :

linjection hydrostatique : plonger lextrmit du capillaire dans


lchantillon en solution et provoquer une aspiration lautre extrmit (2). Ce
mode d'injection est le plus couramment utilis dans les applications
toxicologiques (3).
linjection par lectromigration : Elle est utilisable en lectrophorse
sur gel, et consiste immerger pendant un certain temps lextrmit du

V. Appareillage :
Gnrateur lectrique :

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Gnrateur de courant continu + 2 lectrodes de platine plongeant dans 2 bacs


dlectrolytes ;

Dtection

1. Dtection par UV :

La majorit des systmes commerciaux utilise ce systme.

Dans ce type de systme, une section du capillaire est utilise comme cellule de
dtection.

La dtection directe l'intrieur du capillaire permet l'analyse des soluts sans perte
d'efficacit (1).

On mesure lintensit de la lumire passant travers le capillaire dont une petite zone de
revtement opaque a t limine. Le trs faible parcours optique dans le capillaire rend peu
sensible ce mode de dtection si la solution absorbe peu, dautant que souvent les matrices sont
elles mmes absorbantes (2).

V. Appareillage :
Systmes de dtections :

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2. Dtection par fluorescence :

Peut galement tre utilise en ajoutant un module extrieur a l'appareil commercial.


Ce mode de dtection est beaucoup plus sensible et slectif. En effet, seules les
molcules naturellement fluorescentes ou chimiquement drives peuvent donner un
signal (1).

Pour tendre le champ dapplication de cette forme de dtection on peut faire une prou postdrivation des analytes pour les rendre porteurs dun fluorophore (2).

3. L'lectrochimie : Peut aussi tre utilise comme mode de dtection,


soit en ampromtrie, soit en coulomtrie. Ce mode de dtection est plus
sensible et plus slectif que l'UV (1).

4. Le couplage a la spectromtrie de masse :


possible aussi, afin d'effectuer l'identification des composs spars (1).
trs faible dbit du capillaire se prte bien aux mthodes dionisation pression atmosphrique (2).

Le

VI. Types :

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1. lectrophorse capillaire de zone (CZE) :

Cest le procd dlectrophorse le plus courant.

Llectrolyte est constitu 1). soit par un milieu tampon qui, selon lapplication,
est acide (phosphate ou citrate) ou basique (borate), 2). soit par un ampholyte
(molcule possdant une fonction acide et une fonction basique).

Le flux lectro-osmotique crot avec le pH de la phase liquide. Il peut tre rendu


nul. Ce procd est encore appel lectrophorse en solution libre par opposition
la CGE.

2. lectrophorse capillaire lectrocintique micellaire (MEKC) :

Dans cette variante au procd de base dcrit prcdemment, on ajoute dans la


phase mobile un compos cationique ou anionique, tel le dodcylsulfate de
sodium, pour former des micelles dont le caractre ionique les rend porteuses de
charges. Ces micro-gouttelettes, qui ne sont pas miscibles la solution,
emprisonnent les composs neutres, plus ou moins efficacement, par affinit du
type hydrophile/hydrophobe (2).

VI. Types :

24

3. lectrophorse capillaire sur gel (CGE) :

Cest la transposition de llectrophorse sur gel de polyacrylamide (PAGE) ou


dagarose. Le capillaire est rempli avec un lectrolyte contenant un gel. Celui-ci
produit un effet de filtration qui ralentit les grosses molcules. Les
oligonuclotides, peu fragiles, peuvent tre ainsi spars. Le flux
lectroosmotique reste faible (2).

4. lectrophorse focalisation isolectrique (CIEF) :

Consiste crer un gradient de pH linaire dans un capillaire paroi traite


contenant un ampholyte. Le capillaire plonge dans H3PO4 lanode et dans
NaOH la cathode. Chaque compos migre et se focalise au pH qui a mme
valeur que son potentiel isolectrique (au pI, sa charge nette est nulle).

Ensuite, sous leffet dune pression hydrostatique et en maintenant le champ


lectrique, on dplace les espces spares vers le dtecteur. Les rsolutions
leves obtenues avec ce procd, permettent notamment de sparer des
peptides dont les pI ne diffrent que de 0,02 unit pH.

VII. Prparation des chantillons :

1.

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Le sang et les urines sont deux milieux de choix pour l'analyse toxicologique en EC,
diffrentes approches ont t dcrites pour la prparation des chantillons en vue de
l'analyse des mdicaments et drogues illicites :
Injection sans prtraitement : injection directe aprs une simple
filtration/centrifugation pour liminer les particules susceptibles d'obstruer le capillaire.
Ex : BRB sur srum, analgsiques sur urine.

2. Dilution : Pour minimiser les interfrences de la matrice, la technique la plus simple est
la dilution de lchantillon avec un tampon de force ionique 10 20 fois infrieure celle du
tampon de migration ou avec de l'eau pure.
.

Ex : analyse (ecstasy, amphtamines, hrone, cocane) avec des dilutions par des solutions
basiques ou acides.

Ces deux approches sont rapides, simples, peu coteuses et utilisables en toxicologie
clinique.

En toxicologie mdicolgale, des prtraitements de l'chantillon plus slectifs sont


gnralement prfrs de faon diminuer le bruit de fond d la matrice (SPE, ELL) (3).

VIII. Avantages et
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inconvnients
:
Les performances de llectrophorse capillaire sont intrinsquement comparables

celles de la chromatographie liquide quelle complte utilement pour les sparations de


biomolcules.

La quantit requise dchantillon est trs faible (nL) et la consommation de ractifs ou


de solvants est ngligeable (3).

Temps danalyse trs court (<20).

Grande souplesse (Large domaine doptimisation) :


- Intervention sur nombreux facteurs :
- Couplage des systme de dtection trs performants.
Divers modes (en sol libre, en sol micellaire).
Limite de dtection ng/mL.

Cependant la reproductibilit des analyses est moins sure quen CLHP car beaucoup de
facteurs subtils peuvent affecter la rptabilit des volumes injects. Exige aussi pour
tre reproductible une stabilit thermique + Cout lev.

IX. EC et HPLC

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Compare aux techniques chromatographiques, lEC devient une technologie


trs attrayante par :

Son efficacit: en comparant le nombre de plateaux thoriques des diffrentes


techniques, EC se place devant la plupart des techniques chromatographiques
avec en moyenne une valeur de l'ordre de 250 000 500 000, compar au
chiffre de 40 000 plus couramment rencontr en CLHP.

Sa slectivit, sa facilit d'emploi, sa souplesse et sa rapidit d'excution.

D'autre part, l'utilisation de trs faibles volumes d'chantillon,


la faible consommation de ractifs, le moindre cot des consommables et en
particulier des capillaires, peuvent faire prfrer cette technique aux techniques
chromatographiques.

Cependant LD et LQ sont moins bonnes que les autres techniques chromatog


(sensibilit modeste amliore par le couplage SM) (3).

Conclusion

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L'EC apparat donc comme une technique dont les performances


sont suffisamment bonnes pour que des applications en toxicologie
clinique ou mdico-lgale soient envisages (3).

une moins grande chelle que la fast-LC, l'lectrophorse capillaire


est utilise dans le domaine mdico-lgal comme le prouvent les
toutes rcentes publications rapportant les dosages de stupfiants,
de la metformine, d'antidpresseurs et du paraquat en lui couplant
le plus couramment une dtection par spectromtrie de masse (1).

La possibilit dutilisation de sparateurs chiraux a permis de


rsoudre des problmes difficiles dans l'analyse des nantiomres,
notamment pour les phenthylamines (3).

Rfrences
bibliographiques
1- Kintz P. Trait de toxicologie mdica-judiciare. 2

29
e

dition. Paris.

Elsevier Masson. 2012.


2- Rouessac F, Rouessac A. Analyse chimique. 6e dition. Paris.
Dunod. 2004.
3- Labat L, Deveaux L, Dubqst JP. Applications de l'lectrophorse
capillaire en toxicologie clinique et mdico-lgale. Annal Toxico Anal.
Vol XII, n3, 2000.

MERCI